La technique de cryofracture permet de mettre en évidence les particules protéiques contenues dans la membrane. Mieux, elle permet de comprendre leur localisation précise dans la membrane. Selon leur taille et leur position, elles restent attachées à l'une ou à l'autre face de la membrane.
La cryofracture consiste à geler un échantillon dans l'azote liquide ( -170°C), puis dans une enceinte sous vide à :

 

• casser cet échantillon avec une lame ; la fracture passe par des régions de moindre résistance, c'est à dire au milieu de la double couche lipidique des membranes,
• vaporiser avec un angle un métal lourd qui va se déposer de manière dissymétrique (ombrage) selon le relief de la section (un métal lourd est opaque aux électrons),
• vaporiser du carbone sur toute la surface. Celui-ci constitue donc un moulage de la surface englobant le dépôt de métal,
• réchauffer l'ensemble et nettoyer pour enlever l'échantillon biologique,
• observer la réplique (moulage de carbone et ombrage) au microscope électronique à transmission.

Le schéma ci-dessous permet de définir les différents types d'hémimembranes.

Schéma montrant comment la fracture se réalise au niveau des différentes membranes ; à droite, résultat de la cryofracture.

E : face exoplasmique (vers la lumière du thylacoïde) ;
P : face protoplasmique (vers le stroma) ;
F : fracture ;
s : stack (thylacoïdes accolés) ;
u : unstack (thylacoïdes non accolés).

Microphotographie d'une portion de chloroplaste de chlamydomonas obtenue par cryofracture. On distingue les faces protoplasmique et exoplasmique des thylacoïdes accolés (EFs et PFs) et non accolés (EFu et PFu). (Cliché : Jacqueline Olive).

L'analyse précise de tels documents demande de la part du chercheur une très grande habitude. L'interprétation des différentes faces n'est pas évidente pour un profane.

Voici d'autres exemples pris chez des chloroplastes d'épinards :

Observation par cryofracture d'un chloroplaste d'épinard. (Cliché : Christiane Tuquet).	Détail. Les différentes faces des membranes sont clairement visibles. (Cliché : Christiane Tuquet).
Observation par cryofracture d'une portion de chloroplaste ; deux grana sont bien visibles. (Cliché : Christiane Tuquet).	Détail d'un grana sectionné avec un certain angle. Les différentes faces des membranes sont observées alternativement.( (Cliché : Christiane Tuquet).

Cette méthode de cryofracture permet de localiser sur les différentes faces des particules que l'on peut reconnaître par leur taille et leur densité.
Des méthodes complémentaires permettent de déterminer ce que sont ces particules :

L'utilisation de l'immunocytochimie L'utilisation de mutants déficients

Pour approfondir : les techniques d'étude, la structure des chloroplastes des algues, des plantes supérieures et leur différenciation.