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Le test ELISA (acronyme de Enzyme Linked ImmunoSorbent
Assay) est un test immunologique destiné à détecter
et/ou doser une protéine dans un liquide biologique. Son principe
est indiqué à la page Test ELISA :
détection de la bêta-lactoglobuline bovine.
Dans le test présenté ici, on recherche dans un sérum
de lapin un anticorps dirigé contre la sérum-albumine bovine
(BSA). Les puits d’une microplaque ont été tapissés
à l'avance avec de la BSA qui se fixe au plastique des puits par
interactions électrostatiques. La BSA permet la capture spécifique
des anticorps anti-BSA éventuellement présents dans les sérums
testés. Les anticorps anti-BSA sont ensuite révélés
par un anticorps traceur anti-immunoglobuline de lapin conjugué
à la peroxydase. La réaction de l'enzyme avec la tétraméthylbenzidine
donne un dérivé bleu dont la concentration est proportionnelle
à celle des anticorps détectés. |
Barrettes de microtitration dans leur support
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| Le kit fourni par la société Sordalab
comporte les barrettes de puits recouverts par la BSA et leur support ainsi
que l'ensemble des réactifs nécessaires, soit prêts
à l'emploi (tampon PBS-tween), soit à reconstituer avec de
l'eau distillée ou du tampon phosphate salé (Phosphate
Buffer Saline, PBS) à partir de solutions concentrées
ou de produits lyophylisés selon les instructions données
dans le mode d'emploi.
Si on désire faire un dosage de l'anticorps dans un sérum
inconnu, il convient de réaliser au préalable une gamme de
dilution de la solution d'anticorps initiale de façon à construire
une courbe d'étalonnage. La solution mère d'anticorps, obtenue
en diluant les anticorps fournis dans 15 mL de PBS, comporte 17 µg
d'anticorps de lapin anti-BSA par mL. On l'appellera C1.
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La gamme est réalisée par des dilutions
en série au 1/2 selon les indications du tableau ci-dessous :
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Volume d'anticorps à prélever (mL)
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Volume de PBS à ajouter (mL)
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Nom
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Concentration
(µg.L-1)
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7,5 de C1
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7,5
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C2
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8,50
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7,5 de C2
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7,5
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C3 |
4,25
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7,5 de C3
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7,5
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C4
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2,12
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7,5 de C4
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7,5
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C5
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1,06
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7,5 de C5
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7,5
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C6
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0,53
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7,5 de C6
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7,5
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C7
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0,26
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7,5 de C7
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7,5
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C8
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0,13
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Gamme de dilutions
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| Dans tous les cas, la procédure
est similaire : |
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Déposer 80 µL de sérum à tester ou 80 µL
des différentes dilutions d’anticorps dans les puits et incuber
15 min à température ambiante.
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Vider les puits par retournement et rincer deux fois en remplissant les
puits avec le tampon PBS-tween et en les vidant par retournement.
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Déposer 80 µL de la solution d’anticorps de détection
dans les puits.
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Incuber 15 min à température ambiante.
-
Vider les puits par retournement et rincer deux fois avec le tampon PBS-tween.
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Déposer 80 µL de la solution de révélation (tétraméthylbenzidine,
TMB) et incuber 5 min à température ambiante.
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Gamme de dilution de l'anticorps de lapin anti-BSA
(avant et après addition de la TMB)
La présence d'anticorps anti-BSA se traduit par l'apparition d'une
coloration bleue d'autant plus importante que la concentration en anticorps
est élevée. |
NB Si on ne dispose pas de micropipette automatique,
utiliser des pipettes Pasteur comme compte gouttes pour déposer
les réactifs. Deux gouttes de pipette Pasteur sont équivalentes
à 80 µL.
La quantification des résultats de tests ELISA est réalisée
habituellement avec un lecteur de microplaques. Si on ne dispose pas d'un
tel matériel, ce qui est le cas le plus souvent dans les laboratoires
des lycées, la quantification reste possible. Soit avec un colorimètre
après avoir versé le contenu des puits à analyser
dans des microcuves de spectrophotomètre, soit en mettant à
profit les possibilités de l'informatique : en effet, l'intensité
de la coloration obtenue dans les différents puits peut être
évaluée sur une image numérique des résultats
avec un logiciel approprié comme ceux présentés sur
ce site à la page concernant les applications
de l'électrophorèse en immunologie.
On peut se procurer ce type de logiciel sur Internet aux adresses suivantes
:
Si l'on désire simplement observer le résultat d'un test
qualitatif, on peut utiliser la solution mère d'anticorps comme
témoin positif ainsi que divers témoins négatifs (sérum
normal de lapin, puits sans anticorps traceur, puits sans TMB...). |
En ajoutant 80 µL d'acide chlorhydrique
à 1 mol.L-1 dans chaque puits, la réaction enzymatique
est stoppée et la coloration vire au jaune ce qui permet, le cas
échéant, de quantifier la réaction par colorimétrie
à 450 nm.
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Quelques résultats après traitement par HCl
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Pour déterminer précisément
la concentration en anticorps anti-BSA dans un sérum inconnu, il
est nécessaire de construire une courbe d'étalonnage à
partir des résultats obtenus avec la gamme de dilution de la solution
mère d'anticorps présentée ci-dessus.
Pour cela, une image numérique des résultats au format
.bmp est d'abord obtenue avec un scanner ou un appareil photo et le profil
densitométrique est calculé avec le logiciel de traitement
Digispec
ou Mesurim. Les données sont ensuite traduites graphiquement
avec un logiciel tableur-grapheur quelconque.
Les résultats sont présentés dans le montage ci-contre. |
Superposition des résultats de la gamme étalon
et du profil densitométrique correspondant
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Profil densitométrique d'une
barrette traitée par HCl
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Le même type de traitement peut aussi être réalisé
après traitement des puits par HCl comme le montre le montage ci-contre. |
Les différents paliers du profil sont ensuite quantifiés
en utilisant les fonctions du tableur ou d'un logiciel graphique.
La courbe
étalon, représentant la densité de coloration des
puits en fonction de la concentration en anticorps, est alors
tracée. Pour la gamme de dilutions utilisées, la relation
entre densité de coloration et concentration en anticorps est
linéaire comme le montre la figure ci-dessous correspondant aux
résultats obtenus pour
la gamme C1-C8 sans traitement final par HCl.
Dès lors, la détermination de la concentration en
anticorps
dans d'autres puits peut être déterminée
graphiquement
: après avoir mesuré de la même façon sur
une image numérique la densité
de coloration des puits contenant une concentration inconnue en
anticorps, la densité mesurée est reportée sur la
droite. La concentration recherchée correspond à
l'abscisse de ces points . |
Courbe d'étalonnage
(les étiquettes des points correspondent à la densité
relative de la couleur dans les puits)
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Kit comportant l'ensemble des produits nécessaires :
SORDALAB
ZA DES POUPETTES
91580 VILLENEUVE SUR AUVERS
Téléphone : 0169922672
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