Le test ELISA (acronyme de Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est
un test immunologique destiné à détecter et/ou doser
une protéine dans un liquide biologique. Dans la technique de dosage
dite "en sandwich", les puits d’une microplaque sont tapissés avec
un anticorps de capture capable de lier spécifiquement l’antigène
recherché. Lors de cette opération appelée coating,
l'anticorps de capture se fixe au plastique des puits par interaction électrostatique
L'anticorps de capture assure la spécificité du test. La
solution à tester est ensuite déposée dans les puits
de la microplaque et si l'antigène recherché est présent
il va se lier spécifiquement à l’anticorps de capture. Un
deuxième anticorps, l'anticorps traceur, capable de se lier à
l'antigène capturé est alors ajouté dans le puits
et les anticorps traceurs non fixés sont éliminées
par rinçage. L'anticorps traceur est couplé à une
enzyme catalysant la formation d'un produit coloré. La réaction
peut ainsi être quantifiée par colorimétrie à
partir d'une courbe d'étalonnage réalisée avec des
concentrations connues d'antigène puisque le nombre de molécules
d'anticorps traceur fixées dépend du nombre de molécules
d'antigènes immobilisées par l'anticorps de capture.
C’est le type de test utilisé notamment pour le dépistage
de la séropositivité au virus VIH c'est à dire pour
mettre en évidence la présence d'anticorps anti-VIH dans
le sérum. Toutefois, en clinique humaine, lorsque le test est positif,
il doit être confirmé par un immunotransfert (Western blot)
permettant d’identifier directement les antigènes du virus.
Dans le test présenté ici, produit sous forme de kit
par l'Association des professeurs de biologie géologie (APBG) en
collaboration avec le Commissariat à l'énergie atomique (CEA),
l'anticorps de capture et l'anticorps traceur sont des anticorps monoclonaux
dirigés contre deux épitopes différents de la bêta-lactoglobuline
bovine. L'anticorps traceur est couplé à une acétylcholinestérase
de gymnote, une enzyme particulièrement active. La révélation
de l'activité enzymatique est réalisée avec la méthode
d'Ellman qui utilise un substrat artificiel, l'acétylthiocholine,
dont l'hydrolyse conduit à la formation de thiocholine. Cette dernière
forme un dérivé coloré avec le DTNB (5-5'-dithiobis-[2
nitrobenzoate]) selon l'équation bilan suivante :
Acétylcholinestérase
Acétylthiocholine + H2O ----------------> Acide acétique
+ Thiocholine
Thiocholine + DTNB ---> 5-thio-2-nitrobenzoate + 2-nitrobenzoate-mercaptothiocholine
Incolore
Jaune
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Dans le kit fourni par l'APBG, les barrettes
de microtitration ont déjà subi l’étape du coating
et sont donc prêtes à l’emploi. Elles sont placées
dans un support permettant d'identifier les différents puits par
des lettres correspondant aux lignes et des nombres correspondant aux colonnes.
Les réactifs lyophilisés (anticorps traceur, réactif
d'Ellman, lactoglobuline témoin) sont reconstitués avec de
l'eau distillée selon les instructions données dans le kit.
La recherche de la bêta-lactoglobuline bovine peut être
menée sur du lait de vache ou sur n'importe quel produit soupçonné
de contenir des traces de lait de vache. Le test est suffisamment sensible
pour détecter la présence de lactoglobuline dans un échantillon
provenant d'un mélange d'une goutte de lait de vache dans un litre
d'eau ou d'un extrait aqueux de produit alimentaire solide (gâteau,
biscuit, etc.) comportant du lait dans sa fabrication.
Elle peut servir aussi en classe à simuler un test de dépistage
de la séropositivité à un quelconque agent infectieux. |
Barrettes de microtitration dans leur support
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Déposer dans les puits 100 µL des solutions témoins
(témoin positif : lactoglobuline à 100 ng.mL-1,
témoin négatif : eau) et des solutions à tester (lait
de vache : 1 goutte de lait diluée dans 1 L d'eau distillée,
extrait quelconque soupçonné de contenir la protéine,
etc.).
Ajouter 100 µL d’anticorps traceur (conjugué à
une enzyme, l’acétylcholinestérase) dans chaque puits.
Incuber 30 min à la température ambiante.
Vider les puits en retournant les barettes et les rincer avec une pissette
d’eau distillée pour éliminer l’excès d’anticorps.
Vider l'eau de rinçage.
Déposer dans chaque puits 200 µL de réactif d’Ellman
(substrat de l’acétylcholinestérase).
Incuber 10 min à température ambiante.
NB Si on ne dispose pas de micropipette de précision, délivrer
les réactifs avec une pipette Pasteur munie d'une tétine
à raison de deux gouttes au lieu de 100 µL. |
Quelques résultats
(voir les détails ci-dessous)
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Une réaction positive se traduit par une coloration jaune proportionnelle
à la quantité d’antigène immobilisé par l’anticorps
de capture.
Les résultats ci-contre correspondent aux colonnes A à
F des barrettes numéros 3 et 5. Les échantillons testés
(100 µL) étaient les suivants :
A : témoin positif (lactoglobuline à 100 ng.mL-1)
B : témoin négatif (eau)
C : extrait aqueux de biscuit (1 biscuit dans 250 mL d'eau)
D : lait de vache UHT (1 goutte dans 1 litre d'eau)
E : lait de vache stérilisé (1 goutte dans 1 litre d'eau)
F : eau seule (pas de réactifs) |
Détail des résultats : lignes 3 et 5
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Kit comportant l'ensemble des produits nécessaires :
APBG (Association
des Professeurs de Biologie Géologie)
BP 8337
69356 Lyon Cedex 08
Téléphone : 04 78 74 47 22
Fax : 04 78 01 22 14
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