• Opérations en chambre de culture pour mammifères : sous microscope, CO2, 38°C.
• Activation des ovocytes par agents chimiques (ex: alcool...)
• Emploi d' oeufs fécondés dont les pronuclei male et femelle sont supprimés par aspiration à l'aide d'une micropipette avant la greffe d'un noyau.
• Fusion directe d'un oeuf énucléé avec une cellule donneuse de noyau par la technique d' électroporation ou par l' emploi de virus ( virus Sendaï...)
• Dans tous les cas, culture des oeufs in vitro puis transfert, pour implantation au stade blastocyste, dans l'utérus de femelles receveuses stimulées pour une gestation.

LE CLONAGE NÉCESSITE L'UTILISATION DE NOYAUX PROVENANT D'EMBRYONS TRÈS JEUNES OU DE NOYAUX DIFFÉRENCIÉS REPROGRAMMÉS. SON APPLICATION AUX MAMMIFÈRES FUT RÉALISÉE EN TENANT COMPTE DE CES IMPÉRATIFS ET APRÈS ADAPTATION DE LA TECHNIQUE.

 

 

TRANSFERTS DE NOYAUX PROVENANT D'EMBRYONS JEUNES ET/OU DE CELLULES NON DIFFÉRENCIÉES

Espèces	Origine des noyaux greffés
SOURIS	- Blastocyste : masse cellulaire interne (1977)
MOUTON	- Oeuf en segmentation, stade 8/16 cellules ; Blastocyste stade 64/128 cellules
SINGE Rhésus	- Morula

 

TRANSFERTS DE NOYAUX DIFFÉRENCIÉS AYANT SUBI UNE REPROGRAMMATION

Le 1er clonage réussi chez un mammifère en utilisant des noyaux de cellules d'adultes, fut réalisé chez le mouton. "Dolly" fut obtenue en 1997 par greffe de noyaux de cellules de glandes mammaires. Ces cellules furent mises en culture en milieu dépourvu de sérum (milieu appauvri). Leurs noyaux passent ainsi hors cycle de division (phase G0). Après greffe, ils pourront, par cette reprogrammation, se synchroniser avec le cytoplasme des ovocytes dans lesquels ils seront greffés et se comporter comme des noyaux de fécondation. Au total, 277 transferts de noyaux furent effectués, 29 blastocystes implantés, 1 embryon viable obtenu qui deviendra la brebis "Dolly".

Des cellules souches, cellules peu différenciées, sont présentes dans les tissus chez les adultes. L'utilisation de ce type de cellules peut se présenter comme une technique alternative à la technique du clonage thérapeutique.