Le clonage est l'une des applications de la technique
de la greffe de noyaux mise
au point sur les amphibiens par deux biologistes américains
T.J.
King et R. Briggs en 1952.
Historiquement, les premières expériences de clonage furent
réalisées chez le xénope (amphibien anoure) par
le biologiste anglais J.B. Gurdon
en 1962, puis chez le pleurodèle (amphibien urodèle) en
1966 par Christian Aimar (Université
Pierre et Marie Curie).
Chez les mammifères, le premier clonage à partir
de noyaux d'adultes, fut obtenu chez le mouton par Wilmutt
et ses collaborateurs en 1977.
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PRINCIPE GENERAL
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Obtention d'individus génétiquement identiques par
la technique de greffe de noyaux (greffe nucléaire).
Les noyaux proviennent de cellules diploïdes d'un même
animal et sont injectés dans des ovocytes énucléés
issus d'une femelle de la même espèce.
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Protocole
applicable à l'amphibien Pleurodèle
(Urodèle) |
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- Préparation
des cellules donneuses de noyaux
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Les cellules utilisées
peuvent être des cellules somatiques ou germinales issues
de tissus d'embryons ou d'adultes. Les tissus sont prélevés
et placés dans un liquide physiologique favorisant la
séparation des cellules (milieu dépourvu des ions
calcium et magnésium, additionné d'agents dissociants
cellulaires).
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Dissociation des cellules d'une
blastula:
au centre les cellules endodermiques, en
périphérie, les cellules ectodermiques pigmentées.
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Ils proviennent de femelles
adultes stimulées par hormone gonadotrope hypophysaire.
La ponte s'effectue de 24 à 48 heures après l'injection
hormonale. Des cordons de la ponte sont placés dans des
coupelles contenant du liquide physiologique. Les gangues gélatineuses
protectrices entourant les oeufs sont éliminées
manuellement à l'aide de deux pinces fines, ou par traitement
chimique (action de protéases).
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Chez l'amphibien, les
"oeufs" pondus sont des ovocytes dont les noyaux femelles
sont bloqués au stade métaphase
II de la méiose. Il convient de neutraliser le génôme
des ovocytes : c'est le rôle de l'énucléation
et de relancer les activités métaboliques qui
permettront à terme le développement embryonnaire
: c'est le rôle de l'activation.
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Le
noyau femelle étant situé
à l'apex (pôle animal) de l'ovocyte sous la membrane
plasmique, la piqure d'une aiguille de verre pratiquée
à cet endroit provoque l'expulsion du noyau et celle d'une
faible quantité de cytoplasme. Plus aisément, une
exposition de l'apex des ovocytes à une irradiation aux
rayons ultra-violets (UV) de 90 secondes induit une microfragmentation
de l'ADN de leurs noyaux ce qui entraîne leur inactivation
par dégénérescence.
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Ovocyte secondaire dégangué prêt
à être énucléé et activé.
A l'apex, la métaphase de 2nd division de méiose est
visible par transparence (flèche)
au centre d'une aire de cytoplasme superficiel non pigmenté
(tache de maturation). |
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Activation
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Dans une coupelle contenant
du liquide physiologique, les ovocytes sont disposés
en ligne entre deux électrodes reliées à
un condensateur. Une décharge de 50µF sous 70V,
mimant l'action du spermatozoïde, provoque la dépolarisation
de la membrane plasmique des ovocytes qui déclenchera
le processus d'activation.
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Ovocyte activé par décharge
électrique. La tache de maturation
s'estompe, le noyau a migré en profondeur dans le cytoplasme
tout en achevant sa division méiotique et sa transformation
en un pronucléus
femelle haploïde (non fonctionnel car préalablement
inactivé par les rayons UV).
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AU TERME DE CETTE PRÉPARATION, LES OVOCYTES
N'ONT PLUS DE NOYAU FEMELLE FONCTIONNEL. ILS SONT ACTIVÉS ET APRES
INJECTION D'UN NOYAU DIPLOÏDE PEUVENT ENGAGER, COMME DES OEUFS FÉCONDÉS,
LES PREMIÈRES PHASES DU DÉVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE (PAGE
SUIVANTE).
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