Exemple : anticorps marqué à la fluorescéine
Les colorants fluorescents en vert les plus connus sont des dérivés
de la fluorescéine comme le FITC (Fluoresceine Iso
Thio Cyanate).
Principe général de l'immunofluorescence
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- 1-Si l'on veut détecter une substance
X non soluble (donc fixée) dans la cellule, on l'utilise
comme un antigène en l'injectant à un lapin. Celui
réagit en fabriquant des anticorps (immunoglobulines) anti-X.
- 2-Sur la préparation cellulaire,
les anticorps anti-X se fixent spécifiquement sur X.
- 3-On pourrait fixer une molécule
de fluorescéine directement sur ces anticorps mais il est
plus aisé d'utiliser des anticorps de chèvre anti-immunoglobulines
de lapin soudés à une molécule de fluorescéine.
- 4-Sur la préparation cellulaire,
les anticorps de chèvre anti-immunoglobulines de lapin
se fixent spécifiquement sur les anticorps de lapin anti-X.
- 5-Observée en lumière ultraviolette,
la fluorescéine fixée fluoresce en vert et permet
de localiser la substance X.
- Remarque : de nombreux tests sont nécessaires
pour éliminer toute fixation non spécifique.
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Un fluorochrome est caractérisé par deux spectres : son
spectre d'absorption (de la lumière incidente) et son spectre
d'émission de fluorescence.
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Comme on le voit, la fluorescéine
absorbe les radiations /bleues (max 490nm) et restitue une fluorescence
verte (max 520nm). |
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Le microscope doit être
équipé d'un jeu de filtres correspondant aux caractéristiques
du fluorochrome :
- 1-un filtre d'excitation permettant la sélection
des radiation absorbées par le fluorochrome (autour de
490nm),
- 2-un miroir dichroïque réfléchissant
les radiations absorbables vers l'échantillon et ne laissant
passer par transmission que les radiations vertes et au dessus
(>500nm),
- 3-un filtre d'émission ne laissant
passer par transmission que les radiations vertes et au dessus
(>500nm).
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Optique simplifiée
du microscope à fluorescence
- 1-lampe à arc
- 2-filtre d'excitation
- 3-miroir dichroïque
- 4-objectif
- 5-préparation
- 6-filtre d'émission
- 7-oculaire
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Voici en vue moins schématique les
résultats d'une expérience :
la substance choisie correspond à la tubuline des microtubules
dont on veut connaître la localisation au cours de la mitose.
L'anticorps primaire utilisé est un anticorps anti-tubuline.
L'anticorps secondaire est marqué par de la fluorescéine
(FITC). L'observation est réalisée sur des cellules PTK
en culture (culture obtenue à partir de cellules de rein de rat
kangourou : "Potorous tridactilus Kidney").
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Observation témoin
classique en lumière blanche. |
Observation en utilisant
le jeu de filtres spécifique de la rhodamine. |
Observation
en utilisant le jeu de fitres spécifique de la fluorescéine. |
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Résultat : seule une bonne adéquation
entre le type de jeu de filtres utilisé et le fluorochrome employé
permet des résultats probants : ici, le fuseau et les asters
sont mis en évidence.
Pour connaître
les autres techniques :
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Applications
: les phases de la mitose :
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