On mesure l'absorption de la lumière d'une solution d'hémoglobine
dans le visible avec un spectrophotomètre. Selon l'état de
la molécule d'hémoglobine, ses caractéristiques d'absorption
de la lumière sont modifiées conduisant à des spectres
d'absorption différents. L'identification des principaux maxima
d'absorption (pics) permet ainsi de distinguer les différents états
de l'hémoglobine.
Préparation de la solution d'hémoglobine à partir
de globules rouges
On utilise du sang ou des globules rouges d'animaux (sang de mouton
ou sang de cheval disponibles dans le commerce).
Laisser décanter ou centrifuger 5 mL de sang et éliminer
le surnageant avec une pipette Pasteur munie d'une tétine.
Ajouter au culot 10 mL d'eau distillée et laisser décanter
les débris membranaires ou centrifuger.
Récupérer le surnageant qui constitue la solution stock d'hémoglobine.
On utilisera une solution plus ou moins diluée en fonction de la
couleur de la solution stock (environ au 1/300). Vérifier au spectrophotomètre
que l'absorption maximale reste dans la gamme de mesure de l'appareil.
Si le pic principal est écrêté, diluer davantage.
Obtention des différents états de l'hémoglobine
et des spectres correspondants
Tenir prêts 10 mL de solution d'hémoglobine diluée
comme indiqué précédemment.
Oxyhémoglobine : faire buller pendant quelques
minutes de l'air avec une pompe d'aquarium reliée à un cathéter
dans un tube contenant la solution d'hémoglobine diluée.
Si la solution doit être diluée de nouveau, faire buller de
nouveau de l'air.
Hémoglobine : Ajouter une goutte de
réactif de Stokes pour évacuer l'oxygène et régénérer
l'hémoglobine ou préparer une solution de dithionite de sodium
["hydrosulfite"de sodium] à 50 mg/10 mL et déposer une goutte
de cette solution dans la cuve contenant l'oxyhémoglobine. L'avantage
du réactif de Stokes est la réversibilité.
Méthémoglobine : reprendre 2 mL de la
solution diluée d'hémoglobine. Préparer une solution
de ferricyanure de potassium à 10 mg/10 mL. Déposer une goutte
de cette solution dans la cuve contenant l'hémoglobine.
Carboxyhémoglobine : reprendre 2 mL de la solution
diluée d'hémoglobine. Allumer une cigarette et en souffler
la fumée à travers la solution par un cathéter : le
CO contenu dans la fumée de cigarette détermine la formation
de carboxyhémoglobine très stable.
Carbaminohémoglobine : faire passer un
courant de dioxyde de carbone dans la solution d'hémoglobine par
un cathéter. Si on ne dispose pas d'une bouteille de dioxyde de
carbone, adapter le cathéter sur un bouchon pour erlenmeyer. Déposer
dans l'erlenmeyer quelques grammes de carbonate de calcium. Verser dessus
10 mL d'acide chlorhydrique et adapter immédiatement le bouchon
de façon à ce que le cathéter amène le dégagement
de dioxyde de carbone dans la solution.
Mesures
Verser 2 mL de chaque solution dans une cuvette standard (trajet optique
de 10 mm) et mesurer l'absorption pour l'ensemble du spectre visible
avec une résolution d'au moins 10 nm entre chaque point de mesure.
Si l'appareil le permet, augmenter la résolution dans les régions
des pics présumés d'absorption.
Certains spectrophotomètres effectuent un balayage automatique du
spectre.
Matériel
Tout spectrophotomètre muni d'une sortie analogique peut être
relié à une interface d'acquisition de données et
piloté par un logiciel généraliste.
Les appareils munis d'une interface série se connectent sur le port
série (RS 232) de l'ordinateur et sont pilotés par leur propre
logiciel.
Les enregistrements présentés à la page
des résultats ont été obtenus avec un spectrophotomètre
SECOMAM S 250 PC muni d'une liaison RS 232 avec l'ordinateur et piloté
par le logiciel du fabriquant (voir photo). Le balayage de l'ensemble du
spectre est automatique de 380 nm à 660 nm.
Matériel de mesure :
Spectrophotomètre piloté par ordinateur
