Détermination
par spectrophotométrie de la
concentration
en microorganismes dans une culture
On a souvent besoin lors d'expériences sur les microorganismes,
bactéries, levures, algues unicellulaires, etc. de déterminer
le nombre de cellules présentes dans une culture. Diverses méthodes
peuvent être utilisées comme la numération directe,
les dilutions en série suivies d'étalement sur milieu solide,
la spectrophotométrie. Ces méthodes peuvent s'appliquer tant
aux microorganismes procaryotes, comme les bactéries, qu'aux microorganismes
eucaryotes, comme les levures ou les algues unicellulaires. La méthode
spectrophotométrique est relativement simple à mettre en
oeuvre et présente divers avantages pédagogiques : utilisation
d'un instrument de laboratoire très commun, interfaçage éventuel
avec un ordinateur, construction et exploitation d'une droite d'étalonnage.
Nous prendrons ici l'exemple des levures dont la culture est particulièrement
facile et peut être menée dans les établissements scolaires
pour résoudre divers problèmes biologiques.
Principe
Lorsque des cellules sont en suspension dans un milieu liquide traversé
par un faisceau lumineux monochromatique, la quantité de lumière
absorbée par la suspension est proportionnelle à la concentration
des cellules. La relation entre absorbance et concentration en cellules
est linéaire dans une gamme de concentrations couvrant environ un
ordre de grandeur. En partant d'une suspension de concentration connue,
une gamme de dilution est réalisée et l'absorbance de chaque
suspension est mesurée avec un spectrophotomètre. La droite
Absorbance
= f (concentration en cellules) est alors construite. Pour déterminer
la concentration en cellules d'une suspension, on utilise une méthode
graphique : on mesure l'absorbance d'un échantillon, après
dilution si nécessaire, et on reporte la valeur obtenue sur la droite
d'étalonnage pour en déduire sa concentration. La concentration
en cellules de la suspension servant à construire la droite d'étalonnage
aura été déterminée au préalable avec
une lame à numération (cellule de Malassez ou lame à
numération jetable).
Protocole
Construction de la droite d'étalonnage
Préparer une suspension de levure de boulanger (levure fraîche)
à 0,1 g/100 mL.
Prélever un échantillon de la suspension avec une pipette
Pasteur et remplir la chambre de comptage d'une lame à numération.
Lame à numération KOVA
Au grossissement moyen du microscope, faire la mise au point sur la grille
et compter le nombre de cellules présentes dans un carré.
Si ce nombre est trop élevé, faire une dilution, par exemple
au 1/10 et refaire une numération.
Déterminer le nombre de cellules par unité de volume en suivant
les spécifications données par le fabricant (lame Kova :
multiplier le nombre de cellules par carré élémentaire
par 90 pour obtenir le nombre de cellules par µL).
Régler le spectrophotomètre sur une longueur d'onde rouge
(630 nm par exemple) et déterminer le zéro d'absorbance avec
une cuve remplie d'eau.
Réaliser une série de dilutions de la suspension initiale
(1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16). Il est plus simple de faire les dilutions directement
dans des cuves standards de spectrophotomètre en suivant par exemple
le tableau suivant qui s'applique à une suspension de levures de
boulangerie à 1g/L (0,1 g/100 mL). Utiliser de l'eau physiologique
(NaCl à 9 g/L) comme liquide de dilution.
Volume de la suspension mère
(mL)
Volume d'eau physiologique
(mL)
3
0
1,5
1,5
0,75
2,25
0,375
2,625
0,187
2,812
Mesurer l'absorbance de chaque cuvette.
Construire le graphique Absorbance = f [cellules].
Conserver uniquement les points alignés le long d'une droite.
Droite d'étalonnage : Absorbance =
f [cellules] Cliquer sur la
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Détermination de la concentration en cellules dans une culture
Prélever un échantillon de la culture.
En fonction de son aspect, faire éventuellement une dilution (comparer
avec les cuvettes ayant servi à construire la droite d'étalonnage).
Mesurer l'absorbance de l'échantillon.
Reporter l'absorbance mesurée sur la droite et lire la concentration
sur l'axe des abscisses.
Corriger de la dilution éventuelle du prélèvement.
Détermination graphique de la concentration
Valeur lue : 2 429 cellules par microlitre Cliquer sur la
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