Extraction
et mise en évidence du glycogène
Le glycogène est une macromolécule glucidique présente
chez de nombreux animaux où il constitue une forme de stockage du
glucose. Il s'agit d'un polyoside de structure moléculaire proche
de celle de l'amidon, forme de stockage du glucose rencontrée chez
les végétaux, ce qui lui a valu le nom d'être longtemps
qualifié d'amidon animal. Dans la molécule de glycogène,
comme dans celle d'amidon, des unités glucose reliées par
des liaisons osidiques alpha 1-4 forment une chaîne hélicoïdale
sur laquelle des chaînes secondaires de même constitution se
branchent par des liaisons osidiques alpha 1-6. Dans le glycogène,
ces ramifications sont présentes environ tous les dix résidus
glucose tandis que dans l'amidon, elles sont présentes environ tous
les trente résidus. En présence d'iode, le glycogène
se
colore en brun acajou alors que l'amidon se colore en bleu-violet.
Le glycogène est présent en quantité importante surtout
dans le foie (15 à 50 g/kg) et dans les muscles (1 à 10 g/kg).
Dans les cellules, le glycogène se trouve dans le cytosol où
il forme des granulations de 10 à 40 nm de diamètre souvent
regroupées en rosettes.
L'extraction du glycogène peut être menée soit
à partir d'organes de vertébrés comme le foie et les
muscles, soit à partir d'invertébrés comme les mollusques.
Les moules et les huîtres en contiennent en effet des quantités
notables. Le glycogène extrait peut être mis en évidence
par sa coloration en présence d’eau iodée (lugol). Il peut
aussi servir, comme l'amidon, de substrat aux amylases. Il peut être
hydrolysé entièrement par voie chimique (à chaud,
en milieu acide) ou enzymatique (par une amyloglucosidase) pour montrer
qu'il est exclusivement formé d'unités glucose ou pour déterminer
la quantité de glucose stockée dans tel ou tel organe.
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1. Peser 10 g de foie ou de muscle.
2. Découper l’échantillon en petits morceaux.
3. Broyer dans un mixer électrique (ou avec mortier et pilon
en présence de sable de Fontainebleau) dans 30 mL d’acide trichloroacétique
à 4 %.
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Broyage au mixer
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| 4. Répartir le broyat dans des tubes de
centrifugeuse
5. Centrifuger à 5000 tours par minute pendant 5 minutes.
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Broyat avant centrifugation
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Après centrifugation
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| 6. Récupérer le surnageant.
7. Ajouter deux volumes d’alcool à 95 % à un volume de
surnageant pour faire précipiter le glycogène : des flocons
blanchâtres apparaissent dans le tube si du glycogène est
présent dans l'extrait et le contenu du tube devient trouble.
8. Mélanger en retournant plusieurs fois le tube.
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Précipitation du glycogène
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| 9. Centrifuger à 5 000 tours par minute pendant 5 minutes pour
récupérer le précipité. Le glycogène
forme un culot blanchâtre.
10. Pour récupérer le glycogène, éliminer
le surnageant.
Il est possible de dissoudre le glycogène dans l'eau distillée
et de le faire précipiter de nouveau par l'alcool pour l'obtenir
plus pur.
Si l’on veut peser précisément le glycogène
extrait, il est nécessaire de le sécher. Pour cela, mettre
le tube à l’étuve à 45 °C pendant 24 à
48 h. |
Sédimentation
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Après dissolution dans l'eau du glycogène isolé,
une goutte de lugol ajoutée à la solution fait apparaître
la coloration spécifique du glycogène.
Lugol : 1 g de diiode et 2 g d'iodure de potassium dissous dans
l'eau distillée (de 20 mL à 200 mL selon la concentration
désirée). |
Coloration par l'iode de
l'amidon et du glycogène
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