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MICROSCOPIE à FLUORESCENCE

Utilisation d'un fluorochrome à fluorescence rouge

Les colorants fluorescent en rouge les plus connus sont des dérivés de la rhodamine comme le TRITC (Tetra methyl Rhodamine Iso Thio Cyanate).

Ils sont utilisés par exemple en immunofluorescence.

Principe général de l'immunofluorescence :

  • 1-Si l'on veut détecter une substance X non soluble (donc fixée) dans la cellule, on l'utilise comme un antigène en l'injectant à un lapin. Celui réagit en fabriquant des anticorps (immunoglobulines) anti-X.
  • 2-Sur la préparation cellulaire, les anticorps anti-X se fixent spécifiquement sur X.
  • 3-On pourrait fixer une molécule de rhodamine directement sur ces anticorps mais il est plus aisé d'utiliser des anticorps de chèvre anti-immunoglobulines de lapin soudés à une molécule de rhodamine.
  • 4-Sur la préparation cellulaire, les anticorps de chèvre anti-immunoglobulines de lapin se fixent spécifiquement sur les anticorps de lapin anti-X.
  • 5-Observés en lumière verte, la rhodamine fixée fluoresce en rouge et permet de localiser la substance X.
  • Remarque : de nombreux tests sont nécessaires pour éliminer toute fixation non spécifique.

Un fluorochrome est caractérisé par deux spectres : son spectre d'absorption (de la lumière incidente) et son spectre d'émission de fluorescence.

 Comme on le voit, la rhodamine absorbe les radiations vertes (max 541nm) et restitue une fluorescence rouge (max 572nm).

 

Le microscope doit être équipé d'un jeu de filtres correspondant aux caractéristiques du fluorochrome :

  • 1-un filtre d'excitation permettant la sélection des radiation absorbées par le fluorochrome (ici autour de 541nm),
  • 2-un miroir dichroïque réfléchissant les radiations absorbables vers l'échantillon et ne laissant passer par transmission que les radiations rouges et au dessus (ici >580nm),
  • 3-un filtre d'émission ne laissant passer par transmission que les radiations rouges et au dessus (>560nm).

Optique simplifiée du microscope à fluorescence

  • 1-lampe à arc
  • 2-filtre d'excitation
  • 3-miroir dichroïque
  • 4-objectif
  • 5-préparation
  • 6-filtre d'émission
  • 7-oculaire

Le trajet des radiations lumineuse est complexe.
Le filtre d'excitation sélectionne les radiations spécifiques du fluorochrome... ...qui sont réfléchies par le miroir et éclairent l'échantillon... ...celui-ci émet les radiations de fluorescence qui seules atteignent l'oculaire.

Voici en vue moins schématique les résultats d'une expérience :

La substance choisie comme antigène est constituée d'une enzyme, une pectine-methyl-estérase (PME) dont on veut connaître la localisation dans les cellules de l'hypocotyle de germes de soja. L'anticorps primaire utilisé est un anticorps anti-PME.L'anticorps secondaire est marqué par de la rhodamine (TRITC). L'observation est réalisée sur des coupes transversales d'hypocotyle.
Observation témoin classique en lumière blanche. Observation en utilisant le jeu de filtres spécifique de la rhodamine. Observation en utilisant le jeu de fitres spécifique de la fluorescéine.

Résultats : seule une bonne adéquation entre le type de jeu de filtres utilisé et le fluorochrome employé permet des résultats probants.

Ici, on constate que, dans les parois des cellules, seules les intersections cellulaires (bordure des méats) sont fluorescentes donc contiennent des pectine-methyle-estérases.

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Caroline Benlot, Nicole Blanchouin, Michel Delarue, Michèle Mosiniak, Roger Prat et Véronique Vonarx
Collaboration : Philippe Guillaud

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Mise en ligne : septembre 1999
Dernière modification : juillet 2002