Culture de cellules animales à partir d'embryon de caille

Suzanne Garaix, Lycée International de Lyon

Sommaire

Référence Matériel. Protocole expérimental Résultats au bout de 7 jours Remarques Coût Illustrations

But cognitif :

• faire comparer les milieux de culture
• dégager la notion d'hétérotrophie
• pour algues vertes unicellulaires
• pour levures
• pour cellules d'embryon de caille

But méthodologique :

• travailler dans des conditions strictes d'asepsie.

Résultats attendus :

• Pas de contamination.
• Mutiplications des cellules de l'explant.
• Migration de cellules.
• Différenciation de cellules.

I- Référence

Publication : "Fenêtre sur … les cultures cellulaires animales"

Auteur : Marie-Jeanne Pellerin

CRDP Ile de France, Académie de Créteil, 20 rue Danielle Casanova, 94170 Le Perreux sur Marne

Application : stage de formation à Lyon, Lycée La Martinière, dirigé par M. Grousset, 1997.

II- Matériel

Par groupe de 4 élèves :

• œufs de caille (commande à : Société "La caille de Chanteloup", Le Petit Vélobert, 35180 Corp Nuds).
• 1 loupe binoculaire (nettoyée à l'alcool)
• 2 champs stériles
• 2 paires de petits ciseaux stériles
• 2 petits récipients stériles (pour recevoir l'œuf)
• 1 petite cuillère stérile (cuillère à moka)
• 1 pince stérile
• 1 boîte de Pétri paraffinée, à fond noir stérile
• 6 épingles entomologiques stériles
• 2 microscalpels stériles
• 2 pipettes Pasteur
• 1 tube à centrifuger
• 4 pipettes de 1 ml stériles
• 1 pipette de 2 ml stérile
• 1 flacon de culture quelques ml de Tyrode (milieu physiologique, sels inorganiques et D-glucose) stérile
• 1 tube à centrifuger contenant 1 ml de trypsine EDTA
• 1 tube de 10 ml de milieu de culture (milieu de Leibovitz avec sérum à 10%). Milieu de Leibovitz = milieu de culture constitué de sels inorganiques, galactose, 18 acides aminés, 8 vitamines ; ce milieu s'utilise additionné juste avant emploi de sérum de veau et d'antibiotiques.
• Une centrifugeuse
• 2 petits incubateurs Jeulin à 37°C

III- Protocole expérimental

1^ère semaine : présentation de tout le protocole et de tout le matériel.

Explications (~ 45 min)
Présentation et explications terminées, les élèves se partagent la réalisation du protocole ; 1 des 4 élèves veillera à sa bonne exécution.
Il serait impossible, en une séance de TP, de donner toutes les explications et de réaliser le protocole, d'autant qu'il n'est pas certain que le premier œuf ouvert soit embryonné.

2^ème semaine : réalisation du protocole

œufs à l'étuve à 37°C depuis 4 jours, coupelle d'eau dans l'étuve.

1. Les élèves entrent par la porte du fond de la salle, déposent leurs vêtements au fond de la salle, se lavent les mains au savon puis à l'alcool, se placent devant les paillasses qui ont été javellisées et à côté des becs Bunsen éclairés depuis 40 minutes. Aucun courant d'air, fenêtres fermées.
2. Passer l'œuf à l'alcool à l'aide d'un coton
3. Découper une fenêtre au sommet de la coquille à l'aide des ciseaux.
4. verser le contenu de l'œuf dans un récipient stérile contenant du Tyrode stérile.
5. repérer l'embryon et découper l'aire extraembryonnaire à l'aide de ciseaux.
6. transférer l'embryon dans un petit récipient stérile rempli de Tyrode à l'aide de la petite cuillère, éliminer le jaune résiduel en agitant.
7. transférer l'embryon dans la boîte de Pétri paraffinée à fond noir, remplie de milieu de Tyrode.
8. épingler l'aire extraembryonnaire en inclinant les épingles.
9. observer l'embryon à la loupe binoculaire.
10. dégager l'embryon de ses enveloppes à l'aide des microscalpels.
11. prélever très doucement l'embryon à l'aide d'une pipette Pasteur et l'installer dans un tube à centrifuger contenant 1 ml de trypsine EDTA additionnée de 1% d'antibiotiques.
12. placer le tube contenant l'embryon à l'étuve à 37°C, de 10 à 15 minutes selon la taille de l'embryon.
13. à l'aide d'une pipette Pasteur, aspirer et rejeter plusieurs fois l'embryon qui se désagrège alors ; bien mélanger.
14. centrifuger le tube 10 secondes à 1200 tours minute.
15. jeter le surnageant.
16. ajouter 1 ml de milieu de culture pour faire une suspension cellulaire.
17. introduire stérilement dans le flacon de culture cellulaire 1 ml ou un peu plus de suspension cellulaire.
18. placer le flacon bien horizontalement dans l'étuve à 37°C.

-Dans le fond de l'étuve sont placées :

• 1 coupelle d'eau, 2 petites bougies précédemment allumées

On admet que lorsqu'elles s'éteignent, l'étuve contient suffisamment de CO2 pour la culture cellulaire (conseil donné par un laboratoire de recherches)

-Tous les 2 jours :

• le professeur rajoute de l'eau dans la coupelle, rallume les 2 bougies, (placer pendant la combustion les flacons dans une autre étuve) élimine une partie du milieu de culture et le remplace par du milieu neuf à 37°C.

IV- Résultats au bout de 7 jours

Au-delà les cultures s'abîment. Aucune pollution, dans aucun flacon.
Présence dans les flacons de :

• cellules sphériques
• cellules allongées (forme de navette)
• très beaux fibroblastes
• superbes neurones.

V- Remarques Aucune réticence de la part des élèves.
Séances qui ne sont pas de tout repos pour le professeur !
Très grande satisfaction au vu des résultats
Résultats assurés si l'on suit toutes les rubriques et tous les conseils
Elément variable constaté : durée de l'incubation nécessaire à l'étuve, de 3 à 5 jours

VI- Coût

Culture cellulaire que j'avais inscrite au projet d'établissement en 1997-1998 et également soumise aux instances rectorales en 1998-1999. Crédit accordé en juillet 1999.

MATÉRIEL	FOURNISSEUR	QUANTITÉ	PRIX UNITAIRE	PRIX TOTAL
Milieu de culture L-15 (milieu de Leibovitz)	Société Gibco BRL BP 96 95613 Pontoise Cedex	500 ml		66,00 F
Sérum de veau	Société Gibco	100 ml		108,00 F
Pénicilline + streptomycine	Société Gibco	10 000 UI ; 20 ml		46,00 F
Solution de Tyrode	Société Gibco	1 l		18,00 F
L - glutamine	Société Gibco	20 ml		26,00 F
Trypsine EDTA	Société Gibco	100 ml		58,00 F
Insuline bovine	Société Gibco	5 ml		415,00 F
Milieu complet SFRI4	Société Française de Recherche et d'Investissement 33127 St Jean d'Illac	500 ml		190,00 F
Charbon animal	Société Prolabo 12 rue Pelée, 75011 Paris	1 kg		68,00 F
Paraffine	Société Prolabo	1 kg		64,00 F
Manche à dissection à mandrin	Fisher Scientific Osi BP.2 78996 Elancourt Cedex	4 lots de 5	172,00 F	688,00 F
Aiguille droite	Fisher Scientific Osi	2 lots de 10	85,00 F	170,00 F
Support pour tubes à hémolyse (24 cases)	Fisher Scientific Osi	10	92,50 F	925,00 F
Ciseaux pointe fine	Fisher Scientific Osi	4 lots de 5	80,00 F	320,00 F
Pipette sérologique Corning Verre Pyrex stérile	Fisher Scientific Osi	1 lot de 180	456,00 F	456,00 F
Flacon Costar 3055	Société D. Dutscher 11 rue Christine de Suède 67110 Drumath	200		625,00 F
Petite cuillère inox	Gayet Lyon	4 lots de 6	70,00 F	280,00 F
Epingles entomologiques n°0 Réf. E.432-0	Auzoux 9 rue de l'Ecole de médecine, 75006 Paris	1 boîte de 100	43,00 F	43,00 F
Miniperceuse	Castorama	1	600,00 F	600,00 F
total				5166,00 F

VII- Illustrations

Contact :

Professeur Lafleur

Remerciements

Merci aux membres du laboratoire Biologie et Multimédia pour leur relecture et commentaires.