Dossier - Une nouvelle classe d'ARN : les petits ARN interférents

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3- Les premières applications

Introduction

Ces petits ARN (ARNsi ou ARNmi), susceptibles de détruire spécifiquement un ARNm cible, n'ont pas été longs à entrer dans la panoplie des nouveaux outils de la biologie moléculaire. Ils présentent en effet un double intérêt :

1. de révélateur de la fonction des gènes, puisqu'une fonction qui n'est plus accomplie dit, par défaut, celle que tenait le gène lorsque son ARNm pouvait être traduit en protéine ;
2. d'outil thérapeutique, puisque le message nocif de tel ou tel gène peut être interdit d'expression.

Chez les organismes dont le génome a été séquencé, des comparaisons fines ont permis de retrouver sur les gènes protéiques des séquences correspondant à celles qui donnent naissance aux petits ARN, raison pour laquelle ceux-ci peuvent ensuite s'apparier aux ARNm de ces gènes.
Elles sont de plus en plus engrangées dans des banques ARNi mises à la disposition des chercheurs du monde entier; et l'on sait leur associer les promoteurs qui peuvent les faire s'exprimer dans les cellules où elles sont introduites.

La thérapeutique par petits ARN soulève de grands espoirs, mais les obstacles restent nombreux lorsqu'il s'agit de passer de simples cultures cellulaires à des êtres vivants, et notamment de :

• leur faire gagner les cellules cibles et de leur faire franchir les membranes cellulaires;
• vérifier leur absence de toxicité;
• estimer leur stabilité et donc les doses à administrer;
• s'assurer de leur spécificité.

Trois exemples rendront compte des succès obtenus et des difficultés rencontrées.

Tumeurs cérébrales

Si les tumeurs cérébrales peuvent grossir, c'est qu'à l'instar de toutes les tumeurs solides leurs récepteurs (EGFR) captent activement le facteur de croissance épidermique (EGF).
Entraver par interference-ARN la construction de ce récepteur, empêcherait l'entrée de Ca²⁺ dans ces cellules, lequel stimule à son tour la réplication de leur ADN et donc la prolifération.

Encore faut-il que l'ARNi délivré parvienne à franchir la barrière hémato-encéphalique puis la membrane plasmique des cellules cancéreuses.

Mission accomplie en février 2004 par l'équipe de William Pardridge (Université de Californie, Los Angeles, USA) chez un modèle-souris dont le cerveau avait été injecté de cellules cancéreuses de névroglie humaine (Ref. 6).

Les petites sphères lipidiques (liposomes) qui étaient prodiguées chaque semaine dans la circulation sanguine des souris contenaient des plasmides codant pour le petit ARN en épingle à cheveux (shRNA, voir page sur le mécanisme de l'inhibition) qui allait être à l'origine de la reconnaissance, puis de la destruction des ARNm-EGFR.
Ces sphérules contenaient aussi des anticorps qui, en se liant à des récepteurs spécifiques de la barrière hémato-encéphalique murine (mouse transferrin receptor) et des cellules cancéreuses humaines (human insulin receptor) leur permettaient de franchir ces deux obstacles.

Les souris ainsi traitées survivaient deux fois plus longtemps que leurs congénères témoins; leurs cellules tumorales mises en culture n'absorbaient presque plus de Ca²⁺, de même qu'elles n'incorporaient pratiquement plus la thymidine indispensable à la réplication de leur ADN.

Le petit ARN en épingle à cheveux avait donc bien été transformé en petit ARNi actif, et cela par l'endonucléase Dicer des cellules cancéreuses humaines; et l'ARNm codant pour l'EGFR avait été détruit. Un beau succès obtenu in vivo chez la souris et, techniquement, une magnifique expérience!

Le SIDA

L'interférence-ARN peut-elle être utilisée dans la lutte contre le virus du SIDA ? On peut l'envisager, d'autant que certains succès ont été obtenus. Par exemple, dans des lymphocytes et macrophages en culture infectés par le virus, l'injection d'ARNi est parvenue à détruire les ARNm codant pour des protéines (Tat, Gag ou Rev) indispensables à la réplication du virus, bloquant celle-ci. Hélas, lorsque les cultures se prolongent, le virus du SIDA connu pour son énorme variabilité génétique finit par échapper aux ARNi, qui ne reconnaissent plus leur cible complémentaire sur les ARNm viraux. C'est donc sur toute une gamme d'ARNi et non sur un seul qu'il s'agit de jouer pour contourner cette résistance.

La mise au point d'une stratégie par interférence-ARN contre le virus du SIDA est d'autant plus difficile que macrophages et lymphocytes ne sont pas les seules cibles touchées par le virus. Mais les recherches foisonnent et sans cesse paraissent de nouveaux résultats.

La dégénérescence maculaire

Pour la première fois, et avec l'accord de la Food and Drug Administration, depuis novembre 2004 la thérapie par ARNi est en test clinique de phase I chez l'Homme aux Etats-Unis.

L'objectif est de combattre une maladie de la rétine, liée à l'âge: la dégénérescence maculaire, sous sa variante forme humide (wet-AMD). La maladie peut se déclarer dès l'âge de 50 ans. Elle affecte la macula (ou fovea, voir Fig. 3), cette zone de la rétine constituée uniquement de cônes, qui permet de lire et de distinguer nettement les couleurs. Elle est provoquée par la croissance anormale des vaisseaux sanguins situés en arrière de celle-ci, qui finissent par la recouvrir et par la léser en laissant fuir leur contenu.

Figure 3 : schéma d'une coupe sagittale d'un oeil humain. Pour plus de détails, voir l'article "L'oeil : structure, origine, propriétés physiques".

Les patients commencent par ne plus pouvoir lire, ni conduire, et la cécité survient lorsque la prolifération des vaisseaux gagne toute la rétine. Les moyens de traitement actuels se révèlent souvent impuissants. Or, c'est le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) qui fait proliférer les vaisseaux de la rétine et c'est bien sûr son ARNm ou celui de son récepteur qui pourraient être ciblés par des ARNi.

Des entreprises de biotechnologie les ont mis au point et des essais préliminaires ont été conduits chez des primates, notamment par l'équipe de Reich (Université de Pennsylvania, Philadelphie USA) au début de l'année 2004. L'expérience a consisté à injecter l'ARNi dans le corps vitré de l'oeil, à raison d'une fois toutes les six semaines. Chez les primates traités, les fuites provenant des vaisseaux lésés se sont arrêtées au 21^ème jour, tandis que la construction de nouveaux vaisseaux cessait au 35^ème. Et cela, sans effet nocif, même aux plus fortes doses (Ref. 7).
Des équipes médicales et universitaires sont en train de tester ces ARNi sur quelques patients, en procédant à des injections dans le corps vitré ou dans le blanc de l'oeil. Les premiers résultats seront publiés vers la fin de l'année 2005.

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