Oursins (Paracentrotus lividus
) mâles et femelles vivants, pêchés depuis
moins de 24 heures.
La fécondation et les premiers
stades de la formation d'un embryon peuvent être observés
facilement chez l'oursin. En effet, les gamètes femelles
(ovotides de grande taille) et mâles (spermatozoïdes
flagellés) sont émis à l'extérieur
et la fécondation se réalise dans l'eau de mer.
B. Matériel technique
- Des lames porte-objets dégraissées à
l'alcool à 90 ou 95°, rincées à l'eau
distillée ou à l'eau de Volvic et séchées
verticalement.
- Des lamelles couvre-objets, de 22 mm x 22, 30 ou 36 mm.
- Un tube de vaseline CODEX.
- Des cristallisoirs, béchers et des boîtes de Pétri.
- Des pipettes Pasteur.
- De l'eau de mer récemment prélevée et filtrée, ou du sel de mer d'aquariophilie pour reconstituer
de l'eau de mer à environ 35 grammes pour 1 litre d'eau douce distillée ou d'eau de Volvic.
- Des pissettes en plastique de 100 ou 200 mL.
- Une seringue de 5 mL et une aiguille.
- Une solution 0,53 M de KCl.
- Des micro-aquariums de Schaudin. Il s'agit d'enduire de vaseline deux bords opposés d'une lamelle. On tient la
lamelle entre le pouce et l'index d'une main et on frotte très légèrement le bord de la lamelle contre
l'orifice du tube de vaseline en pressant le tube très doucement. Le mouvement alternatif garnit le bord de la
lamelle d'une couche plus ou moins fine de vaseline ultérieurement compressible ad libitum.
II. Protocole expérimental
A. Récolte des gamètes (par voie naturelle ou chirurgicale)
Quand les oursins sont très frais, la technique la plus simple est de les installer à l'envers, pôle
aboral vers le bas, sur des béchers de taille appropriée. L'émission des produits génitaux
se fait en principe spontanément. Nettoyer soigneusement le pôle aboral à l'eau de mer (pissette en
plastique) et conserver l 'eau de lavage dans un cristallisoir. Etiqueter soigneusement des pipettes (mâles et femelles).
Attendre que les oursins se décident à émettre leurs produits génitaux. On peut accélérer
le processus en injectant, au travers de la membrane péri-buccale, quelques millilitres d'eau de mer ou de 0,5
à 5 mLde KCl à 0,53 M.
Si les oursins se refusent à délivrer leurs produits génitaux par les voies naturelles, couper les
tests avec des ciseaux robustes selon le plan équatorial (l'ambitus). Dans le demi-oursin supérieur (face
aborale), on remarque les 5 gonades, de teintes blanc-jaunâtre pour les mâles, orangée pour les femelles.
Prélever un peu de liquide au sommet de ces gonades, près de la zone péri-proctale, avec des pipettes
Pasteur étiquetées.
B. Réalisation de la fécondation
C'est le temps essentiel de cette manipulation. Il s'agit d'une étape très brève, quelques dizaines
de secondes seulement.
Prélever à la pipette étiquetée femelle une suspension d'ovotides dans les béchers
de la manipulation ou, à défaut, dans les différents liquides de rinçage précieusement
conservés. Instiller le contenu de la pipette sous l'un des bords d'un micro-aquarium préparé. Sous
le bord opposé, instiller, avec une pipette étiquetée mâle, une petite goutte de suspension
de spermatozoïdes.
Il est essentiel que les deux gouttes, à leur dépôt,
ne soient pas confluentes. Installer la lame porte-objet sur la platine du microscope et choisir,
à faible grossissement, une zone riche en ovotides. Appuyer très
doucement sur les bords de la lamelle ; la vaseline, très souple,
s'aplatit
à volonté. On surveille jusqu'à ce que les deux gouttes
confluent, les spermatozoïdes étant attirés par les ovotides,
la fécondation aura en principe lieu sans tarder.
C. Observation des stades ultérieurs
Conserver les microaquariums dans lesquels la fécondation a eu lieu. La première
division (stade 2) se réalise environ au bout de 2 heures et la deuxième (stade 4) au bout de 4 heures.
Pour les stades ultérieurs, conserver un mélange ovotide/spermatozoïde, placer ce mélange le
lendemain dans des microaquariums et observer.
III. Résultats
A. Observation des gamètes
Les gamètes peuvent être observées in situ ou après prélèvement. In
ovaro, on visualise la forme des cellules femelles : les ovocytes
1, diploïdes, avec un noyau très volumineux et un
petit nucléole et, après réduction chromatique,
des gamètes femelles mûres (ovotides), haploïdes
dont le noyau (pronucleus femelle) est sensiblement de la même
taille que le nucléole des ovocytes 1. Ces deux types cellulaires
sont entourés d'une zone mucilagineuse.
Prélèvement des gamètes : à
gauche, un ovotide ; à droite, des spermatozoïdes(contraste de
Nomarsky).
Après prélèvement, on
peut observer les gamètes femelles (ovotides) et les gamètes
mâles (spermatozoïdes) libérés dans le
milieu.
B. Fécondation
Trois étapes montrent la fécondation
d'un ovotide par un spermatozoïde :
A gauche, début du soulèvement de
la membrane de fécondation ( à 5 heures), la tête
du spermatozoïde fécondant est visible. Au centre,
le soulèvement de la membrane se poursuit autour de l'ovotide.
A droite, fin du soulèvement de la membrane de fécondation,
celle-ci représente un obstacle mécanique à
toute autre tentative de fécondation (contraste de Nomarsky).
C. Segmentation.
La cellule-oeuf diploïde,
ou zygote, résultant de la fécondation subit sa
première division après environ deux heures et devient
un embryon à l'abri de la membrane de fécondation.
La segmentation se poursuit jusqu'au stade "blastula".
Première division du zygote : du début de la segmentation
à la fin du stade 2 in vivo (contraste de Nomarsky).
Pour en savoir plus
:
Vous pouvez trouver les étapes ultérieures du
développement sur le site :
Biologie et Multimédia