Protocoles expérimentaux

Mutagenèse chez les levures

Suzanne Garaix, LycéeInternational, 2 Place de Montréal, 69361 Lyon Cedex 07

I. Présentation des levures Saccharomyces cerevisiae ade1 et ade2

Ces levures sont auxotrophes pour l’adénine, elles ne vivent donc pas sur un milieu minimum. Sur un milieu complet (voir Fig. 1), elles commencent la chaîne de réactions qui conduirait à la synthèse de l’adénine, mais il y a blocage par le gène ade 1 ou le gène ade 2, au niveau d’une molécule (phosphoribosylaminoimidazole), qui s’accumule et qui au contact de l’air devient rouge - d’où les colonies rouges. Sur un milieu très particulier, très riche en adénine, les levures ade 1 et ade 2, font l’économie de toute la chaîne de réactions qui conduit à la synthèse de l’adénine - colonies de couleur crème.

Figure 1 : Chaîne de biosynthèse de l’adénine. PRPP : phosphoribosyl pyrophosphate PRA : 5-phosphoribosylamine GAR : glycinamide ribotide ; FGAR : formyl glycinamide ribotide ; FGAM : formyl glycinamidine ribotide AIR : phosphoribosyl aminoimidazole CAIR 5- amino 4- carboxyimidazole ribotide ; SAICAR : 5-amino 4-succinocarboxyimidazole ribotide AICAR : 5-amino 4-carboxamide imidazole ribotide ; FAICAR : 5-formamido 4-carboxamide imidazole ribotide IMP : inosine monophosphate ADS : adénylo succinate ; AMP : adénosine monophosphate ATP : adénosine triphosphate.

Toute l’expérimentation sera menée sur le milieu " complet ", donc avec des colonies de couleur rouge.

II. Matériel

• Une boîte de levures - Saccharomyces cerevisiae ade 1 ou ade 2 - sur milieu solide pour ensemencement, procurée à l’ENS Lyon.
• Un tube à UV à filtre 4 W, 254 nm, avec socle de table.
• Une enceinte isolante en carton ou fabrication maison.
• Deux paires de lunettes anti UV 100 %.
• Deux écrans faciaux.
• Deux visières.
• Produits pour milieu complet : solide (20 g extrait de malt; 2 g extrait de levures; 20 g glucose; 1 l eau distillée; 15 g agar) ou liquide (20 g extrait de malt; 2 g extrait de levures; 20 g glucose; 1 l eau distillée).
• Tubes.
• Boîtes de Pétri.
• Ensemenceur.
• Vortex si possible.

Figure 2 : Appareillage utilisé

III. Protocole expérimental

• Travailler dans des conditions d’asepsie, près d’un bec Bunsen (éclairé avant et durant la manipulation).
• Prélever sur milieu solide, avec la pointe d’un cure dents stérile, des levures ade 1 ou ade 2; prélèvement de la grosseur d’une tête d’épingle.
• Déposer ce prélèvement dans un tube qui contient 3 ml de milieu liquide complet.
• Agiter.
• Faire pousser une nuit à 30 C.
• Le lendemain matin, agiter le tube puis diluer entre 1/3000 et 1/5000 (dans de l'eau distillée stérile).
• Prélever 200 ml de ce milieu dilué, étaler sur une boîte de Pétri contenant du milieu complet solide stérile.
• Préparer ainsi une vingtaine de boîtes de Pétri (même dilution et même volume pour tous les ensemencements).
• Deux boîtes ne seront pas exposées aux U V et seront des témoins.
• Exposer, aussitôt après, toutes les autres boîtes aux rayons UV :
• Se munir de gants, de lunettes anti UV et d’un écran facial avec visière
• Placer une enceinte isolante sur la lampe à UV (enceinte soulevée au moment du passage des boites).
• Le tube UV a été allumé une heure avant l’utilisation et reste allumé durant toute la manipulation : énergie débitée constante.
• Durée d’exposition différente pour chaque boîte : par exemple 2 s; 4 s; 6 s; 10 s; 20 s; 30 s; 60 s; 1 min; 2 min; 3 min, etc...
• Enlever le couvercle juste avant le passage aux UV ( le plus près possible du tube).
• Placer la boîte sans couvercle sur le socle, sous le faisceau UV.
• Refermer aussitôt après exposition.
• Mettre dans l’étuve à 30 C toutes les boîtes de Pétri :
  • Les boîtes témoins.
  • Les boîtes exposées aux UV.

IV. Résultats en 3 à 4 jours

Comparaison de la boîte témoin (colonies rouges) avec :

La boîte ade 2 exposée 10 s : Présence de colonies rouge, aucun changement	La boîte ade 2 exposée 30 s : Nombreuses colonies rouge, quelques colonies crème (nouvelles colonies). Quelques petites colonies blanches (nouvelles colonies).
La boîte ade 2 exposée 90 s : Toutes les colonies sont blanches ou crème.	La boîte ade 2 exposée 150 s : Une seule colonie blanche.
La boîte ade 2 exposée 30 s à plus fort grossissement : Colonies rouges. Colonies crème (nouvelles colonies). Colonies petites blanches (nouvelles colonies).

V. Interprétation par les élèves, explications

Ne pas oublier que ce sont des levures isolées qui ont été soumises à des rayons UV (dilution 1/3000 à 1/5000).

• Durée très faible d’exposition ® aucun effet notable sur les levures.
• Durée d’exposition 30 à 90 s ® présence de nouvelles levures (colonies petites blanches, colonies plus grosses crème).
• Durée d’exposition 150 s ® une seule colonie donc toutes les levures ont été tuées sauf une !

Puisque le nouveau caractère est apparu dans une colonie, il s’agit donc d’un caractère qui se transmet de cellule à cellule, donc la modification porte sur l’ADN. Il s’agit d’une mutation... Puisque nous avons observé 2 types de nouvelles colonies, les rayons UV ont donc provoqué deux modifications différentes de l’ADN.

Discussion élargie à l’environnement :

• Action des rayons UV.
• Importance de la couche d’ozone dans l’absorption des rayons UV.

VI. Remarques

Les résultats obtenus n’ont rien d’absolu, la durée d’exposition nécessaire varie avec le tube à UV utilisé, avec la distance levures tube, etc...

Il faudrait utiliser des milieux sélectifs pour identifier précisément les différentes mutations obtenues, cela n’est pas du niveau de 2^nde

• petites colonies blanches® levures qui ne peuvent plus respirer,
• colonies crème® différentes mutations d’un gène situé en amont de ade 1 ou ade 2 dans la chaîne de biosynthèse de l’adénine,
• etc....

Les rayons UV semblent moins puissants à la périphérie des boîtes : dans certaines boîtes, présence de colonies uniquement à la périphérie (cf. 1 photo). Il a semblé préférable de ne pas exposer les levures aux rayons U V devant les élèves (aucun risque pour les élèves). Tout le matériel, tout le protocole expérimental et évidemment les résultats ont été présentés aux élèves, mais le tube à UV n’était pas allumé. Cela ne gène en rien l’interprétation et la réflexion des élèves. Les élèves ont été très intéressés.

 VII. Conseils

 VIII. Coût du T.P.

A. Matériel commandé à Fisher. Bioblock Scientific, Parc d’Innovation B P, 111., F - 67403 Illkirch.Cedex - France. Fax : 03 88 67 11 68.

IX. Discussion

Didier Pol : A mon avis, il est préférable d'étaler les cellules APRES les avoir irradiées. De cette façon, elles reçoivent une dose d'UV plus homogène. Si elles sont étalées avant l'irradiation, les différentes zones de la boîte ne reçoivent pas la même dose d'UV (distance à la lampe, réflexions éventuelles...). En outre, la mutagenèse est plus efficace en milieu liquide. Ceci explique les observations faites par l'auteur. Mon livre sur les levures étant cité par l'auteur, je vous signale qu'il est possible d'obtenir des précisions sur son contenu à l'adresse : http://wwwusers.imaginet.fr/~pol/5LIVRES.html#TPLEVURES et des résultats expérimentaux de mutagenèse chez la levure à : http://wwwusers.imaginet.fr/~pol/4MUT-LEV.html

Suzanne Garaix : Je suis entièrement d'accord avec la réponse de Didier Pol. De mon côté je m'adresse à des élèves de seconde. Après présentation du protocole que j'ai utilisé et des résultats obtenus (cf.photos), je présente un boîte (cf.photo ci -dessous) où la plupart des levures a ete tuée sauf à la périphérie.

 X. Référence

• Didier Po."Travaux pratiques de biologie des levures" Collection Ellipses.

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