Protocoles expérimentaux

Cultures d'algues vertes unicellulaires (Chlorelles et Chlamydomonas).

Suzanne Garaix, Lycée International de Lyon

Position dans le programme de seconde : Après observation et description de différentes cellules à l’échelle microscopique, ce protocle s’inscrit dans l’étude : "L’hétérotrophie et l’autotrophie sont deux grands types de métabolisme".

But poursuivi : d’après les résultats obtenus, faire conclure sur la composition du milieu nécessaire à la meilleure culture cellulaire de Chlorelles ou de Chlamydomonas et, plus tard, comparer la composition de ce milieu à celui utilisé pour la culture de cellules d’embryon de caille. Dégager la notion d’autotrophie.

Résultats attendus : une meilleure croissance des Chlorelles et de Chlamydomonas sur le milieu complet (sol.1 + sol.2 + sol.3 + sol. 4) et une croissance nettement inférieure sur les milieux sans fer (sol.1 + sol.3 + sol. 4), sans éléments traces (sol.1 + sol.2 + sol. 4), sans NaHCO₃ (sol. 1 + sol. 2 + sol. 3) et sans macrosubstances nutritives (sol. 2 + sol. 3 + sol. 4).

Sommaire

1. Matériel 2. Protocole expérimental 3. Résultat au bout d'une semaine 4. Remarques 5. Coût

• milieu sans fer (sol. 1 + sol. 3 + sol. 4)
• milieu sans éléments traces (sol. 1 + sol. 2 + sol. 4)
• milieu sans NaHCO₃ (sol. 1 + sol. 2 + sol. 3)
• milieu sans macrosubstances nutritives (sol. 2 + sol. 3 + sol. 4)

Erlenmeyers stériles contenant chacun 30 ml de chacun des 5 milieux ci-dessus stériles.

Eau : l’eau utilisée pour la préparation du milieu nutritif et les solutions de substances à expérimenter doit être désionisée ou d’une qualité équivalente. Veiller à éviter toute contamination de l’eau par des substances inorganiques ou organiques pendant la préparation et le stockage. Aucun matériel en cuivre ne doit être utilisé.

Substances nutritives :
Préparer 4 solutions mères dans l’eau, selon les compositions données dans le tableau.
Note : Ces solutions seront éventuellement diluées pour obtenir les concentrations finales en substances nutritives de solutions d’essai. Tous les réactifs utilisés doivent être de qualité analytique.
Stériliser les solutions mères par filtration sur membrane (diamètre moyen des pores 0,2 mm) ou en autoclave (120°C, 15 min).
Conserver les solutions à l’obscurité à 4°C.
La solution mère 4 (NaHCO3) ne doit pas être stérilisée en autoclave, mais uniquement par filtration sur membrane.

Tableau :

Préparation des concentrés nutritifs

Préparer le concentré nutritif comme suit (pour 1000 ml)

Ajouter à 100 ml de solution mère 1 :

• 10 ml de solution mère 2
• 10 ml de solution mère 3
• 10 ml de solution mère 4
• Compléter à 1000 ml avec de l'eau.

Préparer le concentré nutritif juste avant chaque essai. Avant l'utilisation, ce concentré doir atteindre l'état d'équilibre en restant à l'air pendant une nuit ou par un barbotage d'air filtré de 30 min. Après obtention de l'état d'équilibre, ajuster le pH à 8,3 ± 0,2, si nécessaire en utilisant des solutions diluées d'acide chlorhydrique ou d'hydroxyde de sodium (1 mol/l).

1 - Les élèves entrent par la porte du fond de la salle, déposent leurs vêtements au fond de la salle, se lavent les mains au savon, se placent devant les paillasses qui ont été javellisées et à côté des becs Bunsen allumés depuis 40 minutes.

2 - Discussion et réflexion avec les élèves sur le choix de la nature des milieux.

3 - Répartition des 5 milieux par binômes.

4 - Prélèvement, avec une pipette stérile, dans la solution de chlorelles ou de Chlamydomonas, du contenu de 4 eppendorfs, versés dans le milieu à étudier (1 à 4 eppendorfs selon la concentration de la solution de chorelles, un même choix pour tous les binômes).

5 - Comptage du nombre d’algues, du milieu ensemencé, sur cellule de Malassez.

• d’abord, faire repérer la partie graduée à l’œil nu
• ensuite, placer la cellule de Malassez sur la platine microscope, partie graduée au centre du champ, au faible grossissement, valets fixés sur la lame
• repérer la partie graduée au fort grossissement
• enfin, déposer sur la cellule de Malassez en place sur la platine, avec une pipette stérile, une goutte de suspension d’algues initialement agitée
• recouvrir d’une lamelle
• compter le nombre d’algues sur 20 petits carreaux (surface adoptée comme référence).

6 - Mesure de la densité optique, du milieu ensemencé, avec un spectrophotomètre.

• cuve très propre (en principe à usage unique), aucune trace de doigts
• bien repérer la position de la cuve dans l’appareil
• agiter le milieu ensemencé, remplir la cuve à moitié (pour éviter les débordements)
• faire 3 mesures pour un même milieu; les noter
• jeter le contenu des cuves.

7 - Boucher les erlenmeyers, avec du coton stérile passé à la flamme

• étiqueter chaque erlenmeyer (nom du binôme, milieu choisi).
• placer tous les erlenmeyers à 23°C, et à la lumière continue.

1 - Observations à l’œil nu :

• couleur très verte sur milieu (1 + 2 + 3 +4)
• couleur atténuée sur les autres milieux.

2 - Mesure de la croissance cellulaire :

• sur cellule de Malassez (même méthode que 2 .5) résultats très significatifs (exemple sur milieu complet : passage de 6 chlorelles à 100 chlorelles en 7 jours)
• sur spectrophotomètre : résultats très significatifs

3 - Comparaison de tous les résultats des élèves et conclusion :

Sur chlorelles :

Les mesures sur cellules de Malassez sont cohérentes à condition d’en faire un très grand nombre.

Sur Chlamydomonas :

1 - Pas de difficultés particulières lorsque toutes les consignes sont appliquées.

2 - En suivant le protocole donné, les élèves ont trouvé rapidement la graduation de la cellule de Malassez et ont fait des mesures sans difficultés.

3 - La composition des 5 milieux choisis a donné de très bons résultats.

4 - Chlorelles et Chlamydomonas ont été préférées aux Euglènes car ces dernières ont des cellules beaucoup trop grosses et trop mobiles pour être comptées sur cellules de Malassez.

1 - Cette séance utilise en grande partie , des produits chimiques et du matériel de routine, présents dans tout lycée

2 - Matériel spécifique :

• 2 spectrophotomètres, prix unité 10 600 F (empruntés aux physiciens)
• 9 lames de Malassez, prix unité 190,00 F (présentes dans un lycée)

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