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L'invalidation d'un gène : le "Knock-Out"
Gilles Furelaud
I- Pourquoi invalider un gène ?
Les gènes sont à la base de la vie de la cellules, et par là même de celle de l'organisme pluricellulaire. Les cellules de différents organes expriment ainsi des gènes distincts, qui leur permettent d'exercer leurs fonctions. Dans l'organisme en développement, l'expression de gènes spécifiques par les cellules leur permet ainsi de s'engager dans une voie de développement donner, puis de se différencier.
Figure 1 . Le génotype commande le phénotype
Afin de comprendre comment et quels gènes contrôlent les mécanismes et la différentiation cellulaire, les chercheurs ont développé une stratégie : regarder ce qui se passe lorsqu'un gène "fonctionne mal", est absent, etc. Ces études ont d'abords été réalisées grâce à l'étude de mutants, naturels ou provoqués par l'utilisation de produits chimiques ou ionisants. C'est ainsi que, par une startégie de mutagenèse particulièrement importante, Nüsslein-Volhardt, Lewis et Wieshaus ont démontré l'implication des gènes du complexe Hox dans le développement embryonnaire précoce de la drosophile.
Néanmoins, ces techniques de mutagenèse "aléatoires" posent un gros problème : les chercheurs n'ont aucun contrôle sur les mutations qui vont avoir lieu... Ceci impose un fastidieux travail de criblage pour rechercher les mutants. De plus, les mutations obtenues correspondent souvent à une expresion ou une fonction de la protéine correspondant au gène seulement altéré. Il est ainsi difficile de comprendre si l'effet observé est dû à l'absence de la protéine, à une expression incorrecte de la protéine, à la présence d'une protéine modifiée, etc.
Une approche a-priori bien plus intérressante est donc d'éliminer purement et simplement un gène : c'est ce que l'on appelle l'invalidation d'un gène, ou plus communément le KO (Knock-Out) d'un gène. Cette technique est basée sur la recombinaison homologue. Ceci permet, d'après les conséquences observées, de proposer un rôle pour le gène en question.
Figure 2 . La technique du Knock Out consiste en le remplacement des deux copies d'un gène, dans le génome de l'organisme, par un autre allèle (le plus souvent, inactif)
II- Quels sont les prérequis à l'invalidation d'un gène ?
L'invalidation de gènes n'a pu être possible que suite à l'avènement de la biologie moléculaire. Cette technique nécessite en effet de disposer de nombreux "outils moléculaires", permettant la manipulation de fragments d'ADN, et donc de gènes.
Il n'est pas possible de juste se dire "je vais invalider le gène de la bêtise" (ce qui serait pourtant bien utile...). Pour invalider un gène, il est nécessaire de l'avoir identifié au préalable : le gène, sous forme d'un fragment d'ADN, doit avoir été cloné - c'est à dire qu'il doit avoir été isolé, conservé, sa séquence nucléotidique déterminée intégralement. Il est souvent aussi nécessaire de disposer de la séquence nucléotidique des fragments d'ADN bordant ce gène dans le génome de l'organisme étudié.
Figure 3 . Il est nécessaire de disposer du gène à invalider et des séquences le bordant dans le génome avant de pouvoir procéder à son invalidation
Enfin et surtout, il faut avoir une bonne raison d'invalider le gène... Ce processus est long et couteux, et n'est pas employé "à la légère" par les laboratoires de recherche. Il faut compter d'importants moyens techniques (animalerie, matériels), humains (chercheurs, techniciens), et en moyenne deux années de travail pour réaliser un KO chez la souris...
III- Comment fait-on pour invalider un gène ?
| La technique d'invalidation d'un gène se base sur la recombinaison homologue : On peut ainsi remplacer le gène complet, présent dans le génome de l'organisme, par une version suffisamment incomplète du gène pour qu'il ne s'exprime pas, ou par un autre gène (ce qui permet de suivre l'expression du gène invalidé). |
 Figure 4 . Un exemple de méthode pour invalider un gène : le remplacer par un autre gène, par exemple un gène "rapporteur" tel que le gène lac Z (qui code pour la ß-galactosidase) |
La description suivante est faite chez la souris. Elle est valable pour tout organisme Mammifère.
La première étape consiste donc en la création d'un vecteur, portant le gène invalidé :
Figure 5 . Un exemple de vecteur de recombinaison homologue : plasmide bactérien portant le gène lac Z (qui remplace le gène invalidé), avec en amont et en aval des séquences qui entourent le gène à invalider dans le génome de l'organisme
Une fois la construction réalisée, ce vecteur est introduit dans des cellules ES par électroporation. On utilise des cellules ES (Souches Embryonnaires) car ces cellules sont capables de donner toutes les cellules de l'organisme (elles sont totipotentes). Une étape longue et fastidieuse est alors de sélectionner un clone de cellules ES ayant effectivement reçu le vecteur, et ayant procédé à la recombinaison homologue. Une des deux copies du gène est ainsi invalidée dans leur génome :
Figure 6 . Réalisation de cellules ES modifiées. A. Un vecteur a été réalisé : plasmide portant le gène lac Z (dans notre exemple), entouré des cellules bordant le gène A dans le génome. Ce vecteur est introduit dans des cellules ES (transfection). B. Dans quelques cellules ES, un évènement de recombinaison homologue a lieu : grâce à une reconnaissance des séquences communes entre le vecteur et le génome de la cellule, une copie du gène A est remplacée par la construction portée par le vecteur (ici, le gène lac Z). C. La majorité des cellules ES n'ont en fait pas réalisé cette recombinaison homologue. Les quelques cellules ES qui l'ont réalisée sont sélectionée, multipliées, et vont permettre la suite du protocole.
La deuxième étape consiste en l'obtention d'animaux génétiquement modifiés. Pour cela, on procède à l'injection de quelques cellules ES modifiées dans le blastocoele (cavité) de très jeunes embryons de souris. Ces cellules s'intègrent naturellement à la Masse Cellulaire Interne (MCI), ensemble de cellules dont dérivent toutes les cellules du futur organisme. Les embryons ayant reçu ces cellules ES sont alors réimplantés dans des mères porteuses. On obtient ainsi, à la naissance, des souris "mosaïques", dont les tisus dérivent pour partie des cellules de la MCI "normales", et pour partie de cellules ES modifiées :
Figure 7 . L'injection de cellules ES recombinées dans de très
jeunes embryons de souris (ces cellules s'intègrent à l'embryon)
permet l'obtention d'individus mosaïques, dérivant pour partie de
cellules non modifiées, et pour partie de cellules recombinées
Parmis ces individus mosaïques, il est alors nécessaire de selectionner ceux dont les cellules de la lignée germinale dérivent de cellules ES : eux seuls seront capables de transmettre le gène invalidé à leur descendance.
A partir du moment où l'on dispose de tels individus mosaïques, la troisième étape consiste en un croisement entre ces souris et des souris "sauvages" (c'est à dire possédant le gène normal, non modifié). Ce croisement permet d'obtenir des souris hétérozygotes, possédant un allèle sauvage, et un allèle invalidé :
Figure 8 . Le croisement d'une souris mosaïque (dont les cellules sexuelles dérivent des cellules ES recombinées) avec une souris sauvage ne possédant pas cette mutation permet d'obtenir, pour 50% de la descendance, des souris hétérozygotes pour cette mutation.
La dernière étape consiste alors à croiser ces souris hétérozygotes entre elles pour obtenir (dans une proportion de 25%) des souris homozygotes, possédant deux copies du gène invalidé (et donc, logiquement, aucune copie du gène fonctionnel) :
Figure 9 . Le croisement des hétérozygotes obtenus précédemment entre eux permet l'obtention (dans la proportion de 1/4 de la descendance) d'individus homozygotes : ce sont les individus "KO", chez qui le gène a été invalidé
IV- Quels résultats peut-on obtenir suite à l'invalidation d'un gène ?
En résumé, l'invalidation d'un gène par KO consiste donc à remplacer, dans le génome de l'organisme, ce gène par une version modifiée du gène, ne permettant pas son expression :
Figure 10 . L'invalidation d'un gène est le remplacement de ce gène, dans le génome de l'organisme, par une version modifiée, inactive de ce gène. Dans cet exemple, le gène A est remplacé par un autre gène, lac Z. Ce remplacement est permis par la présence de séquences identiques entre la construction et le génome de l'organisme, au niveau desquelles peut se réaliser une recombinaison homologue
Chez les hétérozygotes, le développement n'est en général pas affecté, l'expression de la copie subsistante du gène s'effectuant normalement. Il est de plus souvent possible de suivre alors de manière précise l'expression du gène étudié.
En effet, une technique courante est de remplacer le gène ciblé par un autre gène, qui sera facilement detectable, tel que le gène codant la ß-galactosidase (gène lac Z). Ceci permet d'observer l'expression précise du gène étudié, puisque le gène introduit (lac Z) se retrouve sous le contrôle des séquences promotrices du gène invalidé.
B. Intérêt des homozygotes
Chez les individus homozygotes pour l'invalidation du gène, il est possible d'étudier les différentes conséquences de l'absence de ce gène sur l'organisme. Ceci peut se manifester par des phénotypes très marqués, facilement identifiables, tels que de graves altérations du développement embryonnaire, des malformations, une stérilité, des dérèglements physiologiques. Toutefois, dans de nombreux cas, les effets peuvent être plus délicats à déceler... Ceci peut avoir de nombreuses causes : Il est possible que l'absence du produit du gène soit compensée par l'activation d'autres voies de régulation physiologique. Il est aussi possible que le gène soit redondant avec d'autres gènes.
C'est en particulier le cas des gènes homéotiques. Ces gènes
ont une grande importance chez la drosophile. Leur présence et leur similitude
d'expression chez les Mammifères suggère un rôle important
de ces gènes lors du développement de ces organismes. Mais...
il s'est avéré que de nombreux KO de gènes homéotiques
chez la souris ne conduisent qu'à de très faibles effets phénotypiques.
Comment expliquer ces faits apparemment contradictoires ? Il faut se rappeler
que les gènes homéotiques sont présents sous la forme de
quatre complexes chez les Vertébrés. Ainsi, si on invalide un
gène homéotique au hasard (appelons le Hox Ax : gène gène
Hox numéro x du complexe A) : Il existe souvent deux ou trois autres
gènes homologues, situés dans les autres complexes : par exemple,
Hox Bx et Hox Cx. Ces gènes peuvent très bien s'exprimer d'une
manière très proche de celle de Hox Ax. Ainsi, en l'absence de
Hox Ax, les deux autres gènes (Bx et Cx) peuvent "prendre le relais",
et palier à l'absence de Hox Ax... qui ne se traduit alors que par de
très faibles effets phénotypiques.
Pour ces raisons, une stratégie actuelle est de procéder à
des KO multiples. Dans notre exemple, on procédera ainsi à l'inactivation
simultanée des trois gènes Hox x (des complexes A, B et C). A
la suite d'une telle stratégie, on peut alors, souvent, voir apparaître
(enfin...) un effet phénotypique important, qui permet alors de spéculer
sur le rôle de ces gènes.
On le voit bien, étant donné la complexité des résaux
génétiques dans l'organisme, il n'est pas toujours simple d'interpréter
les phénotypes observés... L'invalidation d'un gène ne
présente donc jamais un résultat final, mais permet seulement
de dégager les grandes directions qui devront être suivies pour
la compréhension parfaite des rôles de ce gènes, ou de la
réalisation de certains phénomènes dans l'organisme.
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Exemple d'invalidation de gène : Hox B8
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exemple d'invalidations multiples : ensemble des paralogues Hox 8 (Hox B8, C8 et D8) Au sein des quatre complexes Hox des mammifères, trois présentent un gène Hox 8 : Hox B8, Hox C8 et Hox D8. Ces trois gènes (dits gènes paralogues) dérivent d'un même gène Hox 8 ancestral, et sont ainsi de séquences très proches. Leur expression chez les mammifères est aussi très similaire : tous trois s'expriment le long de l'axe antéro-postérieur au cours du développement embryonnaire. Hox B8 (voir ci-dessus) et Hox C8 s'expriment de manière très proche; Hox D8 s'expriment dans les mêmes tissus, mais son expression la plus intense est lègèrement décalée vers l'arrière de l'animal. L'invalidation de chacun de ces gène a été réalisée, avec des résultats divers (conventions de notation : C = vertèbre cervicale; T = vertèbre thoracique; L = vertèbre lombaire; chaque vertèbre est suivie de son numéro, la 1 étant la plus antérieure):
Ces trois invalidations montrent un rôle des gènes Hox 8 dans la détermination des devenirs le long de l'axe antéropostérieur, plus précisémment dans la région thoracique. Leur invalidation conduit à une "antériorisation" : les vertèbres présentent un phénotype décalé vers l'avant, par rapport à une souris sauvage. Il est cependant à noter que ces phénotypes ne touchent en général que entre 5 et 7 individus sur 10... Or, on aurait pu penser que, ces gènes étant importants, tous les individus mutés auraient présenté le phénotype... Il a donc été réalisé des doubles invalidations, puis des triples invalidations de ces gènes, conduisant à des individus Hox B8 -/- , Hox C8 -/- , Hox D8 -/- ("triple KO"). Chez tous ces individus, on retrouve les phénotypes caractéristiques des invalidations de Hox C8 et D8. Le plus intérressant se situe au niveau des phénotypes caractéristiques de Hox B8. En effet, on trouve les proportions suivantes de phénotypes :
On peut donc remarquer que le phénotype, présent chez seulement
1/4 des individus en l'absence de Hox B8, est présent chez 4/5
des individus si un deuxième gène Hox 8 est invalidé,
et chez la quasi-totalité des souris, en cas d'invalidation des
trois gènes Hox 8. Cet exemple illustre bien toute la difficulté des invalidations
de gènes : il existe de nombreux gènes paralogues, appartenant
à des familles multigéniques, chez les mammifères.
Lorsque l'on invalide un gène, on ne peut ainsi jamais être
sûr d'observer le phénotype lié au rôle de ce
gène dans l'organisme : Il est souvent possible que d'autres gènes
aient "pris le relais", masquant ainsi plus ou moins le phénotype. (photos aimablement communiquées par le Dr J. Deschamps, Hubrecht Laboratory, Pays-Bas) |
V- Des techniques variantes : le knock-in, la mutagenèse ciblée
La technique de recombinaison homologue peut permettre de réaliser des expériences plus "fines" que la simple invalidation d'un gène.
En premier lieu, il est possible de remplacer, par cette technique, un gène
par un autre : c'est ce qui est réalisé, par exemple, lors de
l'invalidation d'un gène en le remplaçant par un gène "rapporteur"
tel que Lac Z. Dans ce cas là, on a remplacé le gène invalidé
par un gène étranger (bactérien, dans le cas du gène
lac Z). Mais il est possible de le remplacer par un autre gène,
tiré du génome de l'organisme (voir schéma ci-dessous)
:
Par exemple, l'invalidation du gène Engrailed-1, chez la souris, conduit
à des défauts de développement se manifestant au niveau
du cervelet. On peut relier ces défauts à l'expression de Engrailed-1
au niveau de la future région du cervelet, lors du développement
embryonnaire. Un autre gène de la même famille multigénique,
Engrailed-2 s'exprime sensiblement au même endroit un peu plus tard. On
peut remarque que Engrailed-1 et Engrailed-2 on de plus des séquences
très proches. Une expérience réalisée a donc consisté
à remplacer le gène Engrailed-1, dans le génome de la souris,
par le gène Engrailed-2. Cette expérience est nommée un
"Knock-In d'Engrailed-2 dans Engrailed-1". Dans ce cas, on s'aperçoit
que, bien que le gène Engrailed-1 ait été invalidé,
aucun phénotype n'est visible : ceci montre que les deux protéines
issues des gènes Engrailed-1 et Engrailed-2 ont une action potentiellement
équivalente; la différence d'action entre ces deux gènes
se réduit donc en fait à une différence dans le contrôle
(spatial et temporel) de l'expression de ces gènes...
Il est à noter qu'un Knock-In est en fait un cas particulier de Knock-Out.
Les expériences de Knock-In permettent donc d'observer ce qui se passe si l'on remplace un gène par un autre gène, qui lui est proche. On place ainsi ce deuxième gène sous le contrôle de l'ensemble des séquences régulant l'expression du gène invalidé.
La recombinaison homologue permet de remplacer un gène par un autre. Cependant, il est aussi possible de procéder ainsi à une mutation ponctuelle : on peut très bien remplacer un gène A par une version très légèrement différente de ce gène, ne correspondant qu'à une différence au niveau de quelques nucléotides. On procède alors de la même façon que précédemment, en plaçant juste une version modifiée du gène A (voir schéma ci-dessous) dans la construction.
Figure 11 . Bilan : différents résultats sont obtenus, grâce
à la recombinaison homologue, en fonction de la construction réalisée
au départ : Knock Out (invalidation du gène), Knock In (remplacement
par un autre gène), ou mutagenèse dirigée (remplacement
par un allèle muté).
pour accéder à une version plus grande de ce schéma,
cliquez ici. (67
Ko)
| Professeur Lafleur |  |
Un grand merci au Dr. Jacqueline Deschamps (Hubrecht Laboratory,
The Nederlands Insitute for Developmental Biology, Utrecht, Pays-Bas) pour les
photographies de KO des gènes Hox 8.
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