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Les Protoplastes
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6-Viabilité des protoplastes
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La condition nécessaire est naturellement de travailler en conditions aseptiques. Les protoplastes n’étant plus protégés par leur paroi sont immédiatement accessibles aux bactéries. Cette nécessité d’aseptie a certainement été un facteur qui a empéché l’isolement mécanique de se développer. Ce type d’isolement nécessite en effet des manipulations manuelles difficiles à réaliser en conditions aseptiques.

1-Forme sphérique des protoplastes. Les protoplastes vivants sont reconnaissables par leur forme sphérique et la répartition des organites semblable à celle qui caractérise les cellules avant l’isolement. Dans certains cas, après l’isolement, on constate par exemple que certains protoplastes deviennent dissymétrique (chloroplastes et cytoplasme déjetés sur un côté). Ceci se termine souvent par l’éclatement de la cellule. Lavages et centrifugations permettent d’éliminer les protoplastes dégénérés et de ne conserver que les protoplastes viables.

protoplaste vivant
protoplaste disymétrique
protoplaste moribond
protoplaste éclaté
Quatre états de protoplastes de feuille de poireau dans une fraction native de protoplastes isolés;
à gauche, un protoplaste viable; du centre vers la droite, trois éapes de la dégénérescence d'un protoplaste


2-Mouvements de cyclose. Dans certains cas, il est possible d’observer des mouvements de cyclose ce qui est effectivement une preuve de vie.

Cyclose observable dans un protoplaste de radis
Protoplaste de radis fraîchement isolé.
De nombreuses travées cytoplasmiques contiennent des organites dont on pàeut suivre les mouvements de cyclose

3-Présence du noyau. Lorsque les protoplastes sont isolés à partir de cellules aux dimensions isodiamétriques, le protoplaste correspond à la cellule entière. Par contre lorsqu les protoplastes sont issus de cellules allongées, il est fréquent que le cytoplasme se partage et que l'on isole des protoplastes nucléés et des "subprotoplastes" constitués essentiellement de cytoplasme.

subprotoplastes
Plasmolyse d'une cellule allongée d'épiderme d'oignon. Le cytoplasme peut se partager en un protoplaste "vrai" nucléé et un ou plusieurs "subprotoplastes" non nucléés.

4-Test de viabilité cellulaire. On met en présence les protoplastes avec une solution de Di-Acétate de Fluorescéine (FDA ou DAF). Ce produit lipophile pénètre rapidement dans les cellules grâce à la perméabilité de la membrane plasmique. Si la cellule est vivante, ses estérases coupent le FDA et libèrent dans la cellule la fluorescéine acide fluorescente. Celle-ci, non lipophile, ne peut sortir de la cellule qui devient fluorescente.

test de viabilité au di-acétate de fluorescéine
Protoplastes de feuille d’oignon traités par le FDA ou DAF (Di-Acétate de Fluorescéine)

5-Enfin, c’est la suite (synthèse et régénération de la paroi) qui prouvera si les protoplastes étaient viables ou non.

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Roger Prat
 
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