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Les Protoplastes

5-Isolement enzymatique de protoplastes

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5-Isolement enzymatique de protoplastes
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C’est un chercheur anglais,`Cocking, qui a remis l’étude des protoplastes à l’ordre du jour en 1960.
Il a utilisé des enzymes hydrolythiques des polysaccharides sur des tissus de placenta de tomates vertes. Il a ainsi obtenu de très grandes quantités de protoplastes.

Pour obtenir ces enzymes, on utilise des champignons qui dégradent la paroi pecto-cellulosique en présence de substrats provenant de déchets végétaux (Myrothecium verrucaria, Trichoderma viride, Aspergillus niger, etc).
Les activités enzymatiques obtenues dans ces extraits sont assez faibles et peuvent contenir des ribonucléases et des peroxydases toxiques pour la cellule.

Les images suivantes ont été effectuées lors d’une expérience effectuées selon les techniques de Cocking sur des tomates vertes.

Isolement de protoplastes de tomate par digestion enzymatique
Tissu de tomate après ii heure de digestion par les enzymes
Protoplastes de tomate isolés après 4 heures de digestion enzymatique
1 heure de traitement:
les protoplastes sont bien sphériques mais des restes de paroi subsistent 
4 heures de traitement:
les protoplastes sont complètement isolés


Progressivement, des préparations (ou des mélanges à réaliser) ont été commercialisés (par exemple, cellulase Onozuka et Macérozyme).
Certains chercheurs ont utilisé des préparations naturelles comme l’hélicase extraite des glandes salivaires d’escargot.
Certains chercheurs ont utilisé successivement les pectinases (qui séparent les cellules en digérant la lamelle moyenne) puis les cellulases. D’autres ont utilisé le mélange complet en un seul temps.

La technique est simple dans sa conception mais demande une grande maitrise de l'aseptie et des milieux d'incubation. Si l'isolement mécanique ne pouvait se réaliser qu'à partir de cellules allongées, la technique enzymatique peut se réaliser à priori à partir de n'importe quel type de cellules. C'est pourquoi, ce sont très souvent des cellules de parenchyme chlorophyllien qui ont été choisies.

isomement enzymatique de protoplastes

Repprésentation schématique de l'isolement de protoplastes par digestion enzymatique
A-tissu chlorophyllien (lamelle moyenne en rose, paroi cellulosique en bleu);
B-plasmolyse des cellules: les protoplastes in situ se séparent de leur paroi;
C-digestion de la lamelle moyenne par des pectinases: les cellules se séparent;
D-digestion de la paroi cellulosique par des cellulases: les protoplastes sont libres dans le milieu.

Le premier problème était de vérifier si la disparition de paroi était complète. Les tests cytochimiques permettaient de le vérifier. Les images suivantes montrent une préparation qui semblait assez propre. Pourtant, un test cytochimique des polysaccharides montre qu’il existe encore des restes de paroi. Une augmentation de la durée d’action des enzymes s’impose.

tissu en cours de digestion au MET
Tissu en cours de digestion (test des polysaccharides
Population de protoplastes au MET avec un contrastant classique (acétate d’uranyle): aucun reste de paroi n'est visible.
Une section voisine contrastée par un test des polysaccharides: Une trame de paroi légère subsiste.

Le deuxième problème était d’obtenir des préparations homogènes de protoplastes en éliminant les débris cellulaires sans intérêt. Les images suivantes montrent une étape de digestion d’une feuille de poireau.

digestion d'un tissu de feuille de poireau
digestion de feuille de poireau (détail)
Début de la macération d’une feuille de poireau dans les enzymes : les cellules les plus externes se séparent
Surnageant brut avant purification contenant des protoplastes et différents débris de tissus


Le troisième problème est de s’assurer de la viabilité des protoplastes

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auteur de la page : Roger Prat

Bibliographie sommaire:
COCKING E.C., 1960. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature, 187, 927-929
Ouvrage collectif : Protoplastes et fusion de cellules somatiques végétales, Colloques internatiaunaux du CNRS , N° 212, 197

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