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Les Protoplastes
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4-Isolement mécanique de protoplastes
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La première observation de protoplastes est due à Klerker en 1892. En sectionnant des tissus plamolysés, il a observé des cellules sphériques sans paroi. libérées dans le milieu. Cette méthode mécanique a été reprise dans les années 70 de manière plus intensive mais ce sont les digestions enzymatiques de la paroi qui ont prévalues. Cependant, l’isolement mécanique a permis de soulever certains problèmes.
En particulier, l’isolement mécanique, en se passant de toute action enzymatique pouvait sembler plus naturel. En effet, les premiers mélanges enzymatiques utilisés étaient complexes et pouvaient contenir des impuretés préjudiciables à l’intégrité de la cellule.

La technique "mécanique" d'isolement de protoplastes s'adresse à des tissus à cellules allongées et consiste à effectuer des coupes perpendiclairement à la longueur.

-Si on sectionne des cellules en milieu hypotonique, la cellule meurt et la plupart des organites se désagrègent. En maintenant les tissus dans des conditions isotoniques bien précises, on peut récupérer des organites intacts. C'est ainsi que l'on peut obtenir des préparations homogènes de mitochondries ou de chloroplastes.
-Si on augmente la pression osmotique du milieu, on obtient la plasmolyse des cellules et une séparation physique de la membrane plasmique et de la paroi. On observe alors des protoplastes "in situ".
-Lorsqu'on sectionne transversalement le tissu, deux situations sont possibles:

A- La section passe par l'espace de rétraction. Le protoplaste intact peut sortir du cadre pariétal ainsi que divers subprotoplastes.

B- La section lèse le protoplaste. Seuls des subprotoplastes et des vacuoles sont libérés.

isolement mécanique de protoplastes
Une section transversale (flèche rouge) est effectuée sur un tissu à cellules allongées.
Selon que la section lèse ou non le protoplaste "in situ", le protoplaste, des subprotoplastes ou des vacuoles isolées sont libérés.

La proportion de protoplastes entiers et viables, de subprotoplastes non nucléés et de vacuoles dépend de la longueur des cellules. Lorsque les cellules sont isodiamétriques, il y a peu de chance d'obtenir des protoplastes entiers alors que cela est très probable par les méthodes de digestion enzymatique.

L’expérience suivante est réalisée sur des tissus à cellules longues comme de l'épiderme d’oignon. Lorsque les cellules sont bien plasmolysées, les protoplastes ont un contour bien arrondi et sont complètement séparés de leur paroi. Un section effectuée perpendiculairement à l'allongement des cellules passe pour certaines d'entre elles dans l'espace de rétraction sans léser le protoplaste. Celui-ci, intact peut alors sortir de la paroi.

cellules plasmolysées d'épiderme d'oignon
sortie d'un protoplaste d'une cellule plasmolysée d'oignon
Cellules plasmolysées d'épiderme d'oignon. Une section peut passer dans l’espace de rétraction sans léser le protoplaste.
Après la section, un protoplaste intact peut alors sortir de l’enveloppe pariétale.

L’expérience peut aussi se réaliser sur des feuilles d’élodée du Canada qui ont l'avantage d'être très simples à observer "in vivo".

Quatre étapes de la sortied'un protoplaste d'élodée du Canada après section de sa paroi
Trois étapes de la sortie d'un protoplaste d'élodée du Canada après section de sa paroi.
La section n’a pas ouvert complètement la paroi et le protoplaste sort progressivement dans le milieu.

Il est possible de standardiser la méthode mécanique pour obtenir de grandes quantités de protoplastes mais cela ne peut se réaliser qu’avec des organes allongés comme ci-dessous un coléoptile de blé.

sortie de protoplastea au niveau de la section d'un coléoptile
Un protoplaste isolé de coléoptile
Sortie massive de protoplastes au niveau d’une section de coléoptile plasmolysé
Protoplaste isolé de coléoptile

Il est ainsi possible par cette méthode de recueillir de grandes quantités de protoplastes.

population de protoplastes de racine d'oignon isolés mécaniquement
Population de protoplastes isolés à partir de racine d’oignon

On remarque que la population est hétérogène. On distingue des « protoplastes vrais » entiers comportant leur noyau et des « subprotoplastes » sans noyau. En effet au moment de la plasmolyse de cellules très allongées, la cellule peut se fragmenter en plusieurs protoplastes dont un seul est nucléé.

subprotoplastes
Plasmolyse d'une cellule allongée d'épiderme d'oignon. Le cytoplasme peut se partager en un protoplaste "vrai" nucléé et un ou plusieurs "subprotoplastes" non nucléés..

En microscopie électronique, on peut vérifier l‘absence de paroi et la qualité préservée des structures cytoplasmiques.

protoplaste d'oignon au MET
protoplaste mécanique d'oignon au MET
Protoplaste isolé mécaniquement dont la grande vacuole a formé un diverticule pour compenser sa diminution de volume
Protoplaste isolé mécaniquement dans le cytoplasme duquel on observe une certaine contraction des mitochondries

Si les protoplastes mécaniques présentaient un intérêt théorique, il s’est avéré rapidement que seuls les protoplastes isolés enzymatiquement pouvaient amener à des utilisations physiologiques ou génétiques importantes. En effet, l'obtention de protoplastes par la méthode mécanique nécessite des maipulations manuelles importantes qui rendent difficile une aseptie bien contrôlée.

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auteur de la page : Roger Prat

KLERCKER J., 1892. Einemethode zur isokiering lebender protoplasten. Oefvers Vet Acad., 49, 463-475
PRAT R. et ROLAND J.C., 1970. Isolement mécanique et étude ultrastructurale préliminaire de protopllastes végétaux. C.R.Acad.Sc (Paris), D271, 1862-1865.

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