Accueil B.Mol Gen T.P Web

MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLÉCULES

C-Techniques spectroscopiques


4-SPECTROMETRIE DE MASSE

La spectrométrie de masse est une méthode destructive, qui permet à la fois d'accéder à la mesure de la masse moléculaire d'une substance ainsi que d'obtenir des données structurales : la substance ionisée se trouve dans un état excité qui provoque sa fragmentation. L'analyse de ces fragments informe sur la structure de la molécule. Chacun des ions formés est caractérisé par son rapport masse/charge (m/z) et l'appareil est capable de séparer ces ions (par un champ magnétique) et de les détecter/caractériser (qualitativement et quantitativement).

La spectrométrie de masse a récemment élargi son champ d'application, qui était classiquement limité à l'étude des petites molécules organiques (PM < 2.000), pour permettre actuellement d'étudier des macromolécules (PM …… > 100.000), dont il est possible de déterminer le PM à une unité près !

Les appareils peuvent être utilisés soit avec un système d'introduction directe (analyse de substances pures), soit couplés avec un système de chromatographie (TLC, GLC, HPLC, SFC). Certains appareils plus sophistiqués (MS-MS) permettent d'analyser des mélanges sans chromatographie préalable. Le premier étage de MS sert à sélectionner un ion, et le second analysera les ions issus de la fragmentation de celui-ci.

4-1-Différents modes d'ionisation

- EI-MS : Impact électronique

L'ionisation est réalisée dans une chambre d'ionisation où règne un vide de
10-9 à 10-7 Torr. Un faisceau d'électrons est utilisé pour l'ionisation, et la collision soit éjecte un électron de la molécule, donnant une espèce M+, soit la casse en fragments caractéristiques. Selon l'énergie utilisée pour accélérer les électrons, il y aura plus ou moins de fragmentation.

- CI-MS : Ionisation chimique

Cette méthode utilise un gaz réactif (à la pression d'environ 1 mm Hg) qui est ionisé par un faisceau d'électrones et donne une série d'ions qui à leur tour réagissent avec les substances à analyser. On peut utiliser divers gaz, parmi lesquels l'ammoniac, le méthane et l'isobutane. La réaction d'ionisation est la suivante :

Il s'agit d'une méthode "douce", qui casse beaucoup moins les molécules que la précédente.


- FD-MS : Désorption de champ

Cette méthode convient bien aux molécules non volatiles et instables à la température. L'ionisation est réalisée dans un champ électrostatique intense (107-108 V.cm-1) : ces conditions amènent les molécules à perdre un électron sans les chauffer, et l'on n'observe pratiquement pas de fragmentation.

- FAB-MS : Bombardement par des atomes rapides

Cette méthode utilise un faisceau d'atomes neutres (Argon) de grande énergie cinétique pour l'ionisation de substances non volatiles, ionisées ou non, présentes soit à l'état solide, soit sous forme de solution dans une matrice de glycérol. L'ionisation s'effectue à température ambiante et fournit en abondance des ions pseudo-moléculaires ([M+H]+ en mode positif ou [M-H]- en mode négatif).

- Autres méthodes d'ionisation :

La désorption par plasma : le faisceau d'atomes rapides est remplacés par des produits de fissions d'atomes de californium (252Cf), qui produisent un chauffage rapide et l'ionisation des molécules en ions pseudo-moléculaires.
La désorption par laser : dans ce cas les photons d'un faisceau laser provoquent une ionisation douce des molécules organiques et des ions pseudo-moléculaires sont alors formés.

4-2-Analyse des petites molécules

Toutes les méthodes ci-dessus sont utilisables pour l'analyse des petides molécules. Selon leur volatilité et leur fragilité, on est amené à utiliser des méthodes d'ionisation plus ou moins "douces". Lorsque les substances organiques sont des ions (ex. esters phosphate), seul le FAB (FAB+ ou FAB-) permet d'observer des ions "moléculaires". La spectrométrie de masse permet donc de déterminer le poids moléculaire d'une substance, et les diverses fragmentations renseignent sur sa structure : les cassures s'effectuent en des sites privilégiés, par exemple au niveau des liaisons peptidiques ou osidiques pour les peptides et les polyosides respectivement.

4.3-Analyse des protéines : détermination de leur P.M.

Il existe plusieurs méthodes permettant de mesurer la masse moléculaire des protéines, parmi lesquelles :
- la mesure de "temps de vol" (time-of-flight).

Le système utilise la désintégration d'atomes de 252Cf, qui peuvent dans 3% des cas se désintégrer en deux particules (Tc et Ba) émises simultanément et dans deux directions opposées. L'une des deux est immédiatement détectée et donne un signal de départ, tandis que l'autre frappe une "cible" sur laquelle est déposé l'échantillon. Celui-ci va alors émettre de 1 à 10 ions secondaires, qui vont se déplacer à une vitesse inversement proportionnelle à la racine carrée de leur masse. Le temps qu'ils mettent pour atteindre le détecteur (= leur temps de vol) permet donc de déterminer la masse des ions.

 

 

- l'électrospray (ou ion-spray)

La solution contenant les protéines est vaporisée dans une chambre en présence d'un potentiel élevé qui va provoquer une grande ionisation des macromolécules (en moyenne une charge + pour 1000 Da, qui correspond à la fréquence moyenne de 10% des aminoacides basiques dans les protéines). Le système permet l'évaporation du solvant et les ions vont alors pénétrer dans l'analyseur quadripôlaire. On obtient un ensemble de pics correspondant à des m/z différant successivement de une unité au dénominateur, ce qui fournit un ensemble d'équations à partir desquelles on peut déduire la masse de la protéine.

Le spectre d'une protéine contient plusieurs pics (dans la région autour de m/z = 1000), qui correspondent à des espèces multiprotonées de la même molécule, et donc pas du tout à des fragmentations successives de celle-ci.
Ceci permet de calculer la masse moléculaire de la protéine 1 Da. C'est très important, en particulier pour (1) tester la compatibilité avec l'analyse de la composition en acides aminés et (2) pour déceler diverses variations des modifications post-traductionnelles ou (3) identifier la nature d'éventuels groupements N-bloquants, qui empêchent par ailleurs le séquençage selon les méthodes classiques

L'analyse de l'hémoglobine humaine montre en (a) deux séries d'ions multichargés qui correspondent respectivement aux deux chaînes a et b. Une analyse plus approfondie montre dans ce cas particulier que la chaîne ß est en fait un mélange entre la forme normale et un variant de masse très proche (s). Source : Technoscope de Biofutur n°164 (1997).

4-4-Application au séquençage des peptides ou des oligosaccharides

La spectrométrie de masse permet de réaliser un séquençage direct des peptides même lorsque l'extrémité terminale du peptide est bloquée et même si le peptide n'est pas pur. Ceci est effectué par MS-MS. Le premier étage sélectionne un ion correspondant au peptide considéré, et le second étage permet de suivre sa fragmentation. Celle-ci se réalise par coupure au niveau des liaisons peptidiques principalement (et ce à partir des deux extrémités). Il est alors possible de déduire de l'ensemble des ions obtenus la séquence peptidique lue simultanément dans les deux sens.

La même technique (FAB) fournit des éléments d'information sur la structure des oligosaccharides fixés sur les chaînes peptidiques. Il existe des méthodes chimiques simples de déglycosylation des protéines N- ou O-glycosylées, qui laissent intacts les résidus oligosaccharidiques. La MS permet d'obtenir la masse moléculaire des oligosaccharides, et l'analyse des fragmentations renseigne sur la nature des sucres présents. Il est toutefois nécessaire d'utiliser simultanément d'autres techniques complémentaires (clivages enzymatiques, RMN,…).

 


 

 

 

René Lafont
 
Dernières modifications : 28 juin 2005
Tous droits réservés - Biologie et Multimédia - Université Pierre et Marie Curie - UFR de Biologie