Accueil B.Mol Gen T.P Web

MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLÉCULES

C-Techniques spectroscopiques


2-SPECTROMETRIE IR

Il s'agit d'une méthode essentiellement qualitative, qui permet d'obtenir des informations structurales, ou pour tester la pureté d'une substance. Les différentes fonctions chimiques présentes sur une molécule donnée sont responsables de bandes d'absorption caractéristiques.

Exemples de valeurs des vibrations de valence ( C=O ou C-O) de carbonyles, carboxyles et dérivés divers ( = nombre d'onde = 1/).

Les spectres d'absorption IR sont caractérisés par de faibles coefficients d'absorption molaire (compris entre 10 et 1500) : la méthode est donc peu sensible mais il existe maintenant des appareils dits "à transformée de Fourier" qui permettent l'accumulation et le moyennage de spectres successifs d'un même échantillon. En augmentant le temps d'accumulation, on arrive alors à obtenir des spectres avec de très faibles quantités de substance. Les spectres sont obtenus à partir de molécules à l'état gazeux, liquide (à l'état pur ou en solution dans des solvants "transparents" - CCl4, CHCl3, CS2 ou huile de paraffine Nujol®), ou solide (pastillage dans du KBr).

3-SPECTROFLUOROMETRIE

Les substances absorbant de l'énergie se trouvent alors "excitées" et elles doivent ensuite reperdre cette énergie. Ceci se fait le plus souvent sous forme de chaleur mais, dans certains cas, ce retour à l'état initial est lent et la substance peut alors émettre à son tour un photon (de plus basse énergie, donc de longueur d'onde plus élevée que celle de la lumière excitatrice). Ceci se manifeste plus particulièrement avec les substances possédant des cycles polyinsaturés. Les polycycles aromatiques (naphtalène, anthracène,…) et certains hétérocycles (coumarines, indoles,…) sont parmi les composés les plus fluorescents.

 

Quand on excite la substance à une longueur d'onde égale à son maximum d'absorption, celle-ci réémet une lumière que l'on peut mesurer, et dont l'intensité Iz est définie par :

où l'on voit que Iz est proprotionnelle (k) au coefficient d'absorption moléculaire (), à l'intensité de la lumière incidente (Io), au rendement quantique (Qz), à la concentration (c) et à la longueur du chemin optique (l). Cette loi n'est vérifiée que pour des solutions diluées (absorption inférieure à 0,05 Unités de D.O.).

Le rendement quantique Qz est le rapport entre le nombre de photons émis et le nombre de photons absorbés. Il varie entre 0 et 1 et n'a pas de dimension. Il est caractéristique d'une substance donnée à une température donnée et dans un solvant donné. Il diminue (d'environ 1% par °C quand la température augmente), est indépendant de la longueur d'onde (car seul les photons absorbés sont pris en compte) et varie considérablement avec le solvant (d'un facteur 10 à 100).

Les appareils permettent (1) soit de déterminer les spectres de fluorescence (excitation/émission), (2) soit de réaliser des dosages quantitatifs et très sensibles (entre 1000 et 10000 fois plus sensibles qu'en UV-VIS). Il existe diverses réactions chimiques spécifiques permettant de rendre fluorescents des composés qui ne le sont pas naturellement.


 

 

 

René Lafont
 
Dernières modifications : 28 juin 2005
Tous droits réservés - Biologie et Multimédia - Université Pierre et Marie Curie - UFR de Biologie