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MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLÉCULES |
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C-Techniques spectroscopiques |
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1-1-Principe du spectrophotomètre et lois générales :
Variations de I, T et A
Il existe un certain nombre de chromophores "élémentaires" qui absorbent l'UV à des longueurs d'ondes variées.
* spectre dans le n-heptane La présence dans une même molécule de plusieurs de ces chromophores peut se traduire soit (1) par une simple additivité si ces chromophores sont indépendants, soit (2) par des effets bathochromes (déplacement vers les plus grandes longueurs d'onde en UV ou vers le visible) et hyperchromes (augmentation du coefficient d'absorption moléculaire) lorsque ces chromophores sont conjugués. C'est le cas des systèmes diéniques, polyéniques, aromatiques (plusieurs liaisons >C=C<) ou résultant de la conjugaison de chromophores différents. Ces interactions obéissent à des règles qui permettent de prédire la zone d'absorption maximale. Les spectres dépendent également des interactions avec le solvant. Bien évidemment, dans l'eau, les spectres sont très souvent sensibles au pH qui modifie l'ionisation de certaines fonctions chimiques.
Les données de ces
tableaux sont tirées de la référence suivante : Joel
Janin, Méthodes biophysiques pour l'étude des biomolécules 1-3-Dosages (= applications de la loi de Beer-Lambert) : Deux cas sont possibles :
Les conditions d'une bonne méthode de dosage sont les suivantes : -spécificité
: la réaction colorée doit être spécifique
de la substance à doser (qui doit être seule à réagir
avec les réactifs de coloration) 1-3-1-Méthode directe elle consiste à mesurer
A et à calculer c
.
1-3-2-Méthodes indirectes
: elles ne nécessitent pas de connaître a)-Méthode par comparaison avec un étalon unique: - elle consiste à mesurer dans les
mêmes conditions l'absorbance Ad de la solution à
doser et l'absorbance Aet d'une solution "étalon" ou
"standard"de concentration connue cet, puis à calculer
la concentration de la solution à doser cd. b)-Méthode avec une gamme d'étalonnage : - elle consiste à préparer
une gamme de dilutions d'une
solution étalon "mère", à mesurer l'absorbance de
chacune de ces solutions étalons "filles", puis à tracer
la courbe d'étalonnage
A = f(c). L'absorbance de la solution à doser est mesurée
dans les mêmes conditions, puis reportée sur la courbe d'étalonnage;
on fait ainsi une détermination graphique
de la concentration de la solution à doser (la gamme doit encadrer
la valeur probable de la solution à doser) ;
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René Lafont | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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