1-SPECTROMETRIE UV-VISIBLE

Variations de I, T et A

Il existe un certain nombre de chromophores "élémentaires" qui absorbent l'UV à des longueurs d'ondes variées.

Chromophores élémentaires	max (nm)	max (L.mol-1.cm-1)
> C = C < (alcène) - C C - (alcyne) > C = O (cétone) - CH = O (aldéhyde) - COOH (acide) - COCl (chlorure d'acide) - CONH2 (amide) - COOR (ester) - NO2 (nitro) - N = N - (azométhane)	173* 178* 290 279 208 220 220 211 214 338	10000 2000 16 15 32 100 63 57 17 4

* spectre dans le n-heptane

La présence dans une même molécule de plusieurs de ces chromophores peut se traduire soit (1) par une simple additivité si ces chromophores sont indépendants, soit (2) par des effets bathochromes (déplacement vers les plus grandes longueurs d'onde en UV ou vers le visible) et hyperchromes (augmentation du coefficient d'absorption moléculaire) lorsque ces chromophores sont conjugués. C'est le cas des systèmes diéniques, polyéniques, aromatiques (plusieurs liaisons >C=C<) ou résultant de la conjugaison de chromophores différents. Ces interactions obéissent à des règles qui permettent de prédire la zone d'absorption maximale. Les spectres dépendent également des interactions avec le solvant. Bien évidemment, dans l'eau, les spectres sont très souvent sensibles au pH qui modifie l'ionisation de certaines fonctions chimiques.

Chromophores	max	max	Remarques
Chromophores conjugués
>C=C-C=C< (linéaire)	220	30000
>C=C-C=O (dans un cycle)	244	10000
Acides nucléiques
Adénosine	260	15000
Guanosine	255	14000
Thymidine	265	10000
Cytidine	270	9000	sensible au pH
ADN double brin	260		1U.D.O.=50 g/ml
ADN simple brin	260		1U.D.O.= 33 g/ml
ARN	260		1U.D.O.= 40 g/ml
Protéines
Liaison peptidique	190	4-8000	sensible à la conformation
Pont disulfure	250	300
Phénylalanine	257	200
Tyrosine	275	1400	sensible au pH
Tryptophane	280	5600
Coenzymes, hèmes...
Flavine (FMN,FAD)	450	12700	déshydrogénases
NADH, NADPH	338	6400	déshydrogénases
Pyridoxal	390-500	6000	transaminases, décarboxylases
Hème II bande	550	27700
Hème II bande Soret	400	120000	(--> couleur rouge)
Cis-rétinal	498	4200	rhodopsine
Chlorophylle A	660-680	10000	(--> couleur verte)

Les données de ces tableaux sont tirées de la référence suivante : Joel Janin, Méthodes biophysiques pour l'étude des biomolécules
Hermann, Paris 1985 (page 131).

Deux cas sont possibles :
(1)-La substance à doser possède un pic d'absorption caractéristique dans le visible (subtance colorée) ou dans l'UV; on fait alors un dosage direct.
(2)-La substance à doser ne possède pas de pic d'absorption caractéristique; il faut alors effectuer une réaction colorée; on fait alors un dosage indirect.

Les conditions d'une bonne méthode de dosage sont les suivantes :

-spécificité : la réaction colorée doit être spécifique de la substance à doser (qui doit être seule à réagir avec les réactifs de coloration)
-solubilité : le produit coloré obtenu doit être soluble; la solution doit être limpide pour permettre une lecture en spectrophotométrie d'absorption.
-stabilité : la coloration doit être stable pendant un certain temps, pour permettre d'effectuer les lectures sans que la coloration n'évolue; généralement il faut une certaine durée de développement de la coloration pour qu'elle soit stable.
-proportionnalité : l'intensité de la coloration obtenue (son absorbance) doit être proportionnelle à la quantité de substance à doser présente; cela nécessite de mettre les réactifs de coloration en excès (pour que la réaction colorée soit totale), et éventuellement de diluer la solution à doser (pour être dans les conditions de validité de la loi de Beer-Lambert).
-sensibilité : la réaction colorée doit être sensible, pour permettre de doser des solutions de faibles concentrations .

• elle consiste à mesurer A et à calculer c .
• elle nécessite de connaître le de la substance à doser à la longueur d'onde choisie, et de bien caler le monochromateur, car varie avec .

a)-Méthode par comparaison avec un étalon unique:

- elle consiste à mesurer dans les mêmes conditions l'absorbance A_d de la solution à doser et l'absorbance A_et d'une solution "étalon" ou "standard"de concentration connue c_et, puis à calculer la concentration de la solution à doser c_d.
- elle suppose mais ne vérifie pas la linéarité.

b)-Méthode avec une gamme d'étalonnage :

- elle consiste à préparer une gamme de dilutions d'une solution étalon "mère", à mesurer l'absorbance de chacune de ces solutions étalons "filles", puis à tracer la courbe d'étalonnage A = f(c). L'absorbance de la solution à doser est mesurée dans les mêmes conditions, puis reportée sur la courbe d'étalonnage; on fait ainsi une détermination graphique de la concentration de la solution à doser (la gamme doit encadrer la valeur probable de la solution à doser) ;
- elle permet de vérifier la linéarité, et tient compte des éventuelles erreurs de manipulation (tracé d'une droite statistique).