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MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLÉCULES

C-Techniques spectroscopiques


1-SPECTROMETRIE UV-VISIBLE

1-1-Principe du spectrophotomètre et lois générales :

 

Variations de I, T et A

 
I
T
A
Milieu transparent
I0
100%
0
milieu opaque
0
0%
infinie

 

 

1-2-Détermination des chromophores :

Il existe un certain nombre de chromophores "élémentaires" qui absorbent l'UV à des longueurs d'ondes variées.

Chromophores élémentaires

max (nm)

max (L.mol-1.cm-1)

> C = C < (alcène)

- C C - (alcyne)

> C = O (cétone)

- CH = O (aldéhyde)

- COOH (acide)

- COCl (chlorure d'acide)

- CONH2 (amide)

- COOR (ester)

- NO2 (nitro)

- N = N - (azométhane)

173*

178*

290

279

208

220

220

211

214

338

10000

2000

16

15

32

100

63

57

17

4

* spectre dans le n-heptane

La présence dans une même molécule de plusieurs de ces chromophores peut se traduire soit (1) par une simple additivité si ces chromophores sont indépendants, soit (2) par des effets bathochromes (déplacement vers les plus grandes longueurs d'onde en UV ou vers le visible) et hyperchromes (augmentation du coefficient d'absorption moléculaire) lorsque ces chromophores sont conjugués. C'est le cas des systèmes diéniques, polyéniques, aromatiques (plusieurs liaisons >C=C<) ou résultant de la conjugaison de chromophores différents. Ces interactions obéissent à des règles qui permettent de prédire la zone d'absorption maximale. Les spectres dépendent également des interactions avec le solvant. Bien évidemment, dans l'eau, les spectres sont très souvent sensibles au pH qui modifie l'ionisation de certaines fonctions chimiques.

 

Chromophores
max
max
Remarques
Chromophores conjugués      
>C=C-C=C< (linéaire)
220
30000
 
>C=C-C=O (dans un cycle)
244
10000
 
Acides nucléiques      
Adénosine
260
15000
 
Guanosine
255
14000
 
Thymidine
265
10000
 
Cytidine
270
9000
sensible au pH
ADN double brin
260
  1U.D.O.=50 g/ml
ADN simple brin
260
  1U.D.O.= 33 g/ml
ARN
260
  1U.D.O.= 40 g/ml
Protéines      
Liaison peptidique
190
4-8000
sensible à la conformation
Pont disulfure
250
300
 
Phénylalanine
257
200
 
Tyrosine
275
1400
sensible au pH
Tryptophane
280
5600
 
Coenzymes, hèmes...      
Flavine (FMN,FAD)
450
12700
déshydrogénases
NADH, NADPH
338
6400
déshydrogénases
Pyridoxal
390-500
6000
transaminases, décarboxylases
Hème II bande 
550
27700
 
Hème II bande Soret
400
120000
(--> couleur rouge)
Cis-rétinal
498
4200
rhodopsine
Chlorophylle A
660-680
10000
(--> couleur verte)

Les données de ces tableaux sont tirées de la référence suivante : Joel Janin, Méthodes biophysiques pour l'étude des biomolécules
Hermann, Paris 1985 (page 131).

1-3-Dosages (= applications de la loi de Beer-Lambert) :

Deux cas sont possibles :
(1)-La substance à doser possède un pic d'absorption caractéristique dans le visible (subtance colorée) ou dans l'UV; on fait alors un dosage direct.
(2)-La substance à doser ne possède pas de pic d'absorption caractéristique; il faut alors effectuer une réaction colorée; on fait alors un dosage indirect.

Les conditions d'une bonne méthode de dosage sont les suivantes :

-spécificité : la réaction colorée doit être spécifique de la substance à doser (qui doit être seule à réagir avec les réactifs de coloration)
-solubilité : le produit coloré obtenu doit être soluble; la solution doit être limpide pour permettre une lecture en spectrophotométrie d'absorption.
-stabilité : la coloration doit être stable pendant un certain temps, pour permettre d'effectuer les lectures sans que la coloration n'évolue; généralement il faut une certaine durée de développement de la coloration pour qu'elle soit stable.
-proportionnalité : l'intensité de la coloration obtenue (son absorbance) doit être proportionnelle à la quantité de substance à doser présente; cela nécessite de mettre les réactifs de coloration en excès (pour que la réaction colorée soit totale), et éventuellement de diluer la solution à doser (pour être dans les conditions de validité de la loi de Beer-Lambert).
-sensibilité : la réaction colorée doit être sensible, pour permettre de doser des solutions de faibles concentrations .

1-3-1-Méthode directe

• elle consiste à mesurer A et à calculer c .
• elle nécessite de connaître le de la substance à doser à la longueur d'onde choisie, et de bien caler le monochromateur, car varie avec .

1-3-2-Méthodes indirectes : elles ne nécessitent pas de connaître

a)-Méthode par comparaison avec un étalon unique:

- elle consiste à mesurer dans les mêmes conditions l'absorbance Ad de la solution à doser et l'absorbance Aet d'une solution "étalon" ou "standard"de concentration connue cet, puis à calculer la concentration de la solution à doser cd.
- elle suppose mais ne vérifie pas la linéarité.

b)-Méthode avec une gamme d'étalonnage :

- elle consiste à préparer une gamme de dilutions d'une solution étalon "mère", à mesurer l'absorbance de chacune de ces solutions étalons "filles", puis à tracer la courbe d'étalonnage A = f(c). L'absorbance de la solution à doser est mesurée dans les mêmes conditions, puis reportée sur la courbe d'étalonnage; on fait ainsi une détermination graphique de la concentration de la solution à doser (la gamme doit encadrer la valeur probable de la solution à doser) ;
- elle permet de vérifier la linéarité, et tient compte des éventuelles erreurs de manipulation (tracé d'une droite statistique).

 

 

 

 

René Lafont
 
Dernières modifications : 28 juin 2005
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