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MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLÉCULES

B-Techniques éléctrophorétiques

2-APPLICATIONS

L'électrophorèse permet la séparation de molécules chargées : protéines, peptides, acides aminés, acides nucléiques et nucléotides. Elle permet dans certaines conditions (emploi de micelles de détergents ioniques) de séparer des molécules non ioniques, comme des hormones stéroïdes par exemple.

2-1-Séparation des protéines sériques sur acétate de cellulose

La révélation des fractions peut être globale (rouge Ponceau, Amido-schwartz, vert de lissamine, bleu de Coomassie) ou spécifique (révélation des lipoprotéines avec un colorant des lipides, révélation d'une activité enzymatique...).

La lecture peut se faire à l'oeil nu (analyse qualitative) ou par densitométrie (enregistrement de l'absorbance en fonction de la distance de migration) ; dans ce cas, l'intégration des pics permet une analyse quantitative des fractions; ou encore le dosage peut être effectué après élution des fractions.

Tracé densitométrique du protéinogramme d'un sérum humain normal

 

 

2-2-Electrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE)

La polyacrylamide est un gel finement réticulé, que l'on fabrique au moment de l'emploi en mélangeant de

l'acrylamide (CH2=CH-CO-NH2),

qui polymérise en donnant des chaînes linéaires, et du

bis-acrylamide (CH2=CH-CO-NH-CO-CH=CH2)

qui forme des ponts entre les chaînes; on obtient ainsi un réseau, dont les mailles sont de taille variable en fonction des proportions d'acrylamide et de bis-acrylamide utilisées; le gel obtenu se comporte donc comme un tamis moléculaire (les macromolécules migrent d'autant moins vite qu'elles sont plus grosses).

En présence de Sodium dodécylsulfate (SDS), détergent anionique qui défait la structure spatiale et se fixe sur les protéines, toutes les molécules sont chargées de la même façon, et la séparation est alors uniquement fonction de la masse molaire :

(SDS : CH3 - (CH2)10 - CH2 - O - SO3-, Na+),

N.B : pour dénaturer les protéines, on utilise à la fois un détergent comme le SDS et un agent réducteur qui coupera les ponts disulfure, comme le - mercaptoéthanol.

2-3-Electrofocalisation (IEF — IsoElectric Focussing)

La migration est effectuée dans un gradient de pH; chaque molécule migre jusqu'à l'endroit où le pH est égal à son pHi. On utilise un gel de forte porosité (polyacrylamide ou agarose), pour que la taille n'influence pas la migration. Le gradient de pH est généré par des ampholytes, molécules amphotères de synthèse introduites dans le gel au moment de sa fabrication : on utilise un mélange de telles molécules, possédant des pHi dans une certaine gamme (gamme large, ex. 3-9, ou ▒ étroite, ex. 4-5 ou 5-6,5). Ces molécules migrent rapidement dans le gel jusqu'à atteindre une zone où leur charge devient nulle. Elles ont alors une distribution statistique telle qu'elles génèrent un gradient de pH sensiblement linéaire le long du gel. Il existe de telles molécules de petit poids moléculaire et solubles (ampholines) et il existe également des gels a base d'acrylamide modifiée contenant des groupements acides et basiques fixés (gels d'immobilines).

L'électrofocalisation bidimensionnelle est une méthode qui permet d'obtenir une courbe de titrage d'une protéine donnée (charge = fonction du pH). On prépare un gel dans lequel on établit le gradient de pH, puis on dépose dans une rigole centrale la solution de protéine, après quoi on tourne la plaque de 90 ° et on fait à nouveau passer un courant électrique.

 

2-4-Electrophorèse bidimensionnelle

On sépare selon le pHi dans une dimension (IEF) et selon la masse molaire dans l'autre dimension (PAGE-SDS); on sépare ainsi environ 1000 protéines dans le sérum !

 

On peut établir de cette manière la "carte d'identité protéique" des principaux tissus et organes humains. La lecture nécessite alors un système informatisé d'analyse d'images.

 

2-5-Electrophorèse sur agarose

Elle est peu utilisée dans le cas des protéines, car dans ce domaine les gels de polyacrylamide donnent toute satisfaction. Cependant, des gels d’agarose sont utilisés sous forme de kits prêts à l'emploi en biologie clinique : ils sont alors destinés à des applications spécifiques pour révéler un type donné de constituant (ex. lipoprotéines) ou certaines enzymes (déshydrogénases, estérases,…), ainsi que pour les techniques de révélation par anticorps (qui peuvent plus facilement diffuser au sein du gel, voir + loin).

2-6-Immunoélectrophorèse

La révélation est basée sur une réaction "antigène-anticorps". On mettra de côté l'immunoblot, qui consiste à visualiser des protéines sur un gel (la fixation d'Ac étant révélée par un second anticorps marqué). Les techniques ci dessous utilisent le fait qu'à des concentrations adéquates, du fait de la présence de familles d'anticorps (polyclonaux) et de la bivalence de ces anticorps, il se forme des agrégats (= réaction d'immunoprécipitation. Ce précipité est ensuite coloré selon les techniques classiques.

Il existe en fait tout un ensemble de techniques qui utilisent des anticorps associés à des séparations électrophorétiques. On peut distinguer les techniques suivantes :

2-6-1-Immuno-électrophorèse de Grabar et Williams

Les protéines migrent dans un gel d'agarose, puis on les révèle par une technique de double diffusion des antigènes et des anticorps, donnant des arcs de précipitation. Avec un antisérum total, on peut par exemple distinguer 30-40 protéines dans le sérum humain. On peut bien sûr l'utiliser également avec un antisérum spécifique.

 

 

2-6-2-Electro-immunodiffusion double (= électrosynérèse)

Cette méthode dérive en fait de la technique d'immunodiffusion double d'Ouchterlony. Elle consiste à accélérer la diffusion par un champ électrique. Les conditions électrophorétiques sont choisies de façon à ce que les antigènes et les anticorps migrent en sens inverse (ceci est possible car le pHi des Immunoglobulines est supérieur à celui de beaucoup de protéines).

 

 

2-6-3-Electro-immunodiffusion monodimensionnelle (Laurell)

Les protéines sont déposées sur des gels contenant l'antisérum. On se place à pH où les Ig migrent peu. Les protéines se déplacent et rencontrent les anticorps qui forment alors des précipités en forme de fusée appelés "rockets" dont la hauteur est proportionnelle à la concentration en protéine. On utilise une partie des puits pour faire un étalonnage.

 

 

2-6-4-Electro-immunodiffusion bidimensionnelle (Laurell)

On sépare les protéines dans une première dimension en gel d'agarose. On coule ensuite un gel contenant l'immunsérum polyspécifique, puis on réalise la seconde dimension.

 

2-7-Electrophorèse en champs pulsés

Cette technique est utilisée pour l'électrophorèse des molécules d'ADN de haut poids moléculaire (15 -100 kb). Dans cette gamme de taille (au-delà de 20 kb), les molécules ne sont plus séparées par les méthodes classiques, car la migration devient indépendante de la taille (le déplacement de ces molécules cyclindriques ayant toutes le même diamètre s'effectuant par "reptation"). L’emploi de deux champs orthogonaux utilisés en alternance fait que les molécules d'ADN, qui mettent un certain temps à s'orienter dans le sens du champ électrique, ne migrent que lorsque celle-ci est réalisée. Le temps nécessaire à l’orientation est d’autant plus grand que la molécule d’ADN est longue.

 

Il devient alors possible de séparer les molécules en fonction de leur longueur. Cette méthode s'avère très utile dans les analyses du génôme des procaryotes et des eucaryotes.

2-8-Electrophorèse capillaire

C'est une technique récente qui commence à se développer et qui offre essentiellement les avantages de la rapidité, de la très grande résolution et, partant, de la très grande sensibilité de la détection. L'électrophorèse utilise un capillaire de silice de diamètre d'environ 50 Ám et de longueur 1 m (rempli de tampon ou de gel), et des voltages élevés (15 -30 kV). Ceci aboutit à des vitesses de migration très rapides des composés dans le capillaires et ceux-ci sont détectés par absorption UV, fluorimétrie ou conductimétrie directement sur le capillaire, donc dans un volume très faible. Ceci fournit donc une sensibilité particulièrement élevée (on injecte seulement quelques nanolitres de l’échantillon).

 

Les domaines d'application sont a priori nombreux : analyse de peptides, d'acides aminés, d'oligonucléotides,… le nombre de plateaux est de l'ordre de 500000 par mètre, ce qui fournit une résolution remarquable (on peut séparer des peptides différant d'un acide aminé, des mélanges complexes d'oligonucléotides, des fragments tryptiques de peptides ; la méthode est utilisée pour tester la pureté de peptides ou d'oligonucléotides de synthèse,…). La technique peut également s'appliquer à des molécules non ionisées en présence de micelles de détergents appropriés.

Electrophorèse capillaire en solution libre (FSCE)

Dans l’électrophorèse capillaire, le courant d'endosmose est la force dominante (il entraîne tous les solutés quelle que soit leur charge) et il dépend des charges présentes sur la paroi du capillaire (qui est fonction du pH); ce courant diminue à pH acide.

 

Electrophorèse capillaire micellaire (MCE)

Les micelles de détergent (SDS) forment une phase pseudo-stationnaire et le soluté se partage entre celle-ci et la phase mobile. Les substances les plus apolaires sont davantage "retenues" et la séparation obtenue s'apparente à celle de la HPLC en phase inverse.

 

Electrofocalisation en électrophorèse capillaire (CE-IEF)

 

René Lafont
 
Dernières modifications : 28 juin 2005
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