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MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLÉCULES

B-Techniques éléctrophorétiques

1-DEFINITION ET PRINCIPES DE FONCTIONNEMENT

Définition : L'électrophorèse est une méthode de séparation de particules chargées électriquement par migration différentielle sous l'action d'un champ électrique. Le terme d'ionophorèse est utilisé dans le cas d'ions de petite taille.

L’électrophorèse libre, en veine liquide selon Tisélius (1937), est réalisée dans un tube en U de section carrée (ceci afin de pouvoir réaliser des mesures optiques au travers du tube, comme avec une cuve de spectrophotomètre) : la séparation n'est pas totale, mais les frontières qui se forment sont mises en évidence par des méthodes optiques (absorption UV, indice de réfraction, fluorescence...). Cette méthode est utilisée en recherche pour mesurer la mobilité électrophorétique et pour vérifier la pureté des protéines.

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L’électrophorèse sur support ou électrophorèse de zones permet de stabiliser la phase liquide grâce à l’utilisation d’un support poreux imprégné d'un solvant tamponné.
Appareillage: -Le support doit être homogène, poreux et inerte (cette dernière condition n'est jamais totalement réalisée).

 

 

On peut utiliser du papier, de l'acétate de cellulose, du gel de polyacrylamide, du gel d'agarose, du gel d'amidon, du gel de silice, ...

- On peut procéder sur bande (papier, acétate de cellulose), sur lame ou en tube (gels)

Principes de la migration électrophorétique : la migration dépend de plusieurs facteurs :

• de la mobilité électrophorétique U, qui est fonction de la charge et de la géométrie de la particule. Une particule de charge électrique Q, placée dans un champ électrique E, est soumise à une force F qui l'entraîne vers l'électrode de signe opposé :

Des forces de frottement f, dues à la viscosité du milieu , s'opposent à la migration de la particule, et ce d'autant plus que la particule est grosse (r = rayon) et que la vitesse de migration (v) est grande :

 

 

(N.B. Le coefficient de viscosité dépend de la température)

Il arrive un moment où ces deux forces s'équilibrent, et la particule se déplace alors à vitesse constante; on peut alors écrire:

On définit pour chaque particule sa mobilité , de manière indépendante du champ électrique, par la relation :

La mobilité est une caractéristique de chaque particule; il est donc possible d'effectuer une séparation en se basant sur cette propriété.

La charge Q est fonction du pH isoélectrique de la particule et du pH du solvant : on appelle pH isoélectrique d'une particule (pHi ou pI) le pH pour lequel cette particule ne migre pas dans un champ électrique (ceci est une définition expérimentale). Pour les molécules de petite taille, on peut prévoir la valeur du pHi en calculant le pH isoionique, pH pour lequel la charge nette est nulle, à partir des pKa des différents groupements ionisables de la molécule; mais cela n'est pas possible pour les macromolécules, car leur environnement ionique modifie notablement leur charge réelle.

La différence pH - pHi détermine le signe de la charge Q d'une particule :

si pH > pHi

charge nette négative (anion)

migration vers l'anode

si pH < pHi

charge nette positive (cation)

migration vers la cathode

si pH = pHi

charge nette nulle

pas de migration

La différence pH - pHi détermine l'intensité de la charge Q d'une particule : plus cette différence est grande en valeur absolue, plus la charge est importante.

 

• du champ électrique E : E = v /
• des courants liquidiens :

- le courant d'électro-endosmose :

Dans les conditions expérimentales, le support se charge négativement; une couche mobile de charges positives se forme dans le solvant, au contact du support et entraîne globalement la phase liquide vers la cathode.

Ce courant accélère ou ralentit la migration des molécules, suivant qu'elles migrent vers la cathode ou vers l'anode. Il peut dans certains cas être plus puissant que les forces électriques, ce qui fait que des protéines chargées négativement peuvent globalement migrer vers la cathode : c'est particulièrement vrai avec les gels d'agarose et nous le verrons aussi dans le cas de l’électrophorèse capillaire.

- les courants d'évaporation : le passage du courant s'accompagne d'un échauffement du support (par effet Joule), ce qui entraîne l'évaporation de l'eau de la phase liquide; cet effet est maximal au milieu de la bande; il s'établit ainsi un courant liquidien depuis chaque extrémité vers le centre de la bande. Pour limiter ce phénomène, la cuve est fermée par un couvercle; on utilise aussi des cuves réfrigérées.

 

• de la durée de migration, qui influe sur la distance de migration :

d = v . t

(d = distance, v = vitesse , t = temps de passage du courant)

Cette formule n'est pas applicable dans le cas de l'électrophorèse sur support, car les molécules effectuent un trajet non linéaire dans les microcanaux du support poreux.

• de facteurs liés à la nature du support : adsorption, texture...

 

René Lafont
 
Dernières modifications : 28 juin 2005
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