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MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLÉCULES

D-Techniques de dosage

2-L'ÉVOLUTION DES TECHNIQUES DE DOSAGES : CAS DES HORMONES STÉROÏDES

Historiquement, on disposait de dosages peu sensibles et peu spécifiques :

• dosages/tests biologiques (ce sont les premiers à avoir été utilisés)
• dosages colorimétriques (réaction de Zimmermann)
• dosage chimique en mesurant la fluorescence induite en milieu sulfurique concentré (corticostéroïdes)

Ensuite, on a vu se développer des méthodes de séparation chromatographique :

• chromatographie sur papier
• chromatographie sur couche mince

Associées aux méthodes précédentes, elles procuraient une certaine spécificité, la sensibilité de l'ordre du g, nécessitant encore des volumes sanguins non négligeables. Ceci représente l'état des techniques au début des années 60. Pendant la période 1960-70, deux méthodes sont apparues :

• la méthode de dérivatisation avec deux isotopes = méthode de double dilution isotopique : ajout d'un stéroïde 3H et réaction avec un réactif 14C; la mesure du rapport isotopique 3H/14C dans le dérivé obtenu permet de doser le stéroïde dans l'extrait (ce rapport diminue quand la quantité de stéroïde augmente)

• la chromatographie en phase gazeuse (détection par ionisation de flamme, capture d'électrons, ou spectrométrie de masse), permet de descendre au nanogramme, voire au picogramme; elle implique la formation préalable de dérivés volatils.

A la fin des années 60, les dosages radioimmunologiques (RIA) sont apparus, méthodes simples, sensibles et spécifiques. Par ailleurs, les techniques de séparation ont également progressé avec l'apparition de la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Plus récemment, il a été proposé de supprimer l'emploi des isotopes et de les remplacer en ayant recours à des enzymes. Ceci présente l'avantage de la sécurité face aux rayonnements, mais en fait les substrats chromogènes sont souvent des molécules relativement toxiques, voire cancérigènes, et dans certains cas (pas tous) le problème de sécurité a été déplacé, mais pas supprimé.

D'autres protéines possédant une forte affinité pour les stéroïdes - récepteurs ou protéines de transport du plasma ont également été utilisées à la façon des anticorps (par exemple pour du RRA - radioreceptor assay).

 

 

 

René Lafont
 
Dernières modifications : 28 juin 2005
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