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MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLÉCULES

D-Techniques de dosage

On peut de façon générale distinguer plusieurs types de dosages :

• les dosages chimiques ou physicochimiques, qui s'appliquent pour des composés présents en quantité relativement importante (gravimétrie, colorimétrie, chromato-graphie, etc.)
• les dosages biologiques, pour les substances biologiquement actives (ex. hormones), qui ont surtout un intérêt "historique" mais les tests de grossesse - pour doser hCG dans l'urine - ont été utilisés jusqu'en 1970 environ
• dosages immunologiques, plus récents et utilisés à de très nombreuses fins.

1-DOSAGES/TESTS BIOLOGIQUES (BIOESSAIS - CAS DES HORMONES)

Ce sont les premiers - et en général les seuls disponibles au début - et ils sont nécessaires pour l'isolement des molécules que l'on caractérise par leur/une activité biologique, à la base de :

• bioessais qualitatifs ou de
• bioessais quantitatifs

Remplacés ultérieurement par d'autres méthodes plus performantes, ils conservent encore tout leur intérêt dans la recherche systématique (screening) des activités biologiques de substances naturelles ou de synthèse (recherche de substances antitumorales, d'agonistes ou d'antagonistes d'hormones, d'insecticides,…)

1-1-Les tests de grossesse

La présence de hCG dans les urines des femmes enceintes permet de faire un diagnostic biologique de la grossesse.

 

Inoculée à une lapine impubère, cette hormone fait apparaître dans l'ovaire des follicules saillants et hémorragiques bruns tout-à-fait comparables à ceux dûs aux hormones hypophysaires.

 

 

1-2-Dosage biologique des œstrogènes

Les premiers dosages, dûs à Allen et Doisy (1923), mettent à profit l'existence de réactions vaginales importantes aux œstrogènes chez les rongeurs : chez ces derniers, les différentes phases du cycle œstrien s'accompagnent de modifications cycliques de l'épithélium vaginal, qui comportent une kératinisation des cellules superficielles qui desquament au moment de l'œstrus. L'extrait supposé contenir des œstrogènes est injecté en sous-cutané à une ratte castrée, et 48-56 heures après on examine un frottis vaginal de l'animal. L'unité-rat est la quantité minimale d'oestrogènes qui induit l'apparition de cellules kératinisées. Il suffit d'injecter 0,3 g de benzoate d'œstradiol ou 2-3 g d'œstrone dans un véhicule lipidique (forme de libération progressive) pour observer une réponse positive.

En choisissant un animal plus petit, la souris, 0,1 g de benzoate d'œstradiol ou 0,35 g d'œstrone suffisent.

L'utilisation d'une introduction directe de l'extrait dans le vagin permet d'augmenter la sensibilité, on peut alors détecter 0,003 g. Si l'on utilise l'index mitotique mesuré sur des coupes de vagin, on peut encore augmenter la sensibilité d'un facteur 10. On voit donc qu'en fait un bioessai optimisé peut être très sensible. Toutefois, un tel bioessai n'est pas quantitatif.

 

 

Des bioessais quanti-tatifs ont été mis au point par Lauson en 1939, qui consistent à déterminer le poids de l'utérus de rattes immatures 4 jours après une série d'injections (2 fois par jour pendant 3 jours). On obtient dans ce cas une courbe dose-réponse (sigmoïde) permettant un dosage :

1-3-Le test Calliphora pour doser les ecdystéroïdes

Le bioessai utilisé (le test Calliphora) a été développé en 1939 par Becker et Plaage. Il consiste à ligaturer des larves de 3ème (dernier) stade d'une mouche (Calliphora erythrocephala) relativement grosse (70-90 mg) en arrière de l'anneau de Weissmann (la source de l'hormone de mue). Après 24 h, la partie antérieure devient sombre et tannée, tandis que l'abdomen reste mou et blanc. C'est à ce moment que l'on injecte une solution contenant éventuellement de l'hormone de mue (ecdysone) et on regarde 24 h après si les animaux montrent des signes de formation d'un puparium. Ce bioessai est semi-quantitatif, et n'a bien sûr pu être calibré que lorsque de l'ecdysone pure a été disponible.

C'est grâce à ce bioessai que Butenandt et Karlson ont pu suivre la purification de l'ecdysone au cours des étapes de partition ou de chromatographie, en repérant les fractions biologiquement actives.

Courbe dose-réponse dans le test Calliphora.

Une "unité-Calliphora" est définie comme la quantité d'ecdysone qui induit la formation du puparium dans 50% des animaux ligaturés, soit ici entre 10 et 20 ng/animal.

 

D'autres dosages biologiques sur le même principe ont ensuite été développés utilisant des animaux plus petits, d'où une plus grande sensibilité (2 ng avec le test Musca).

 

 

Le degré d'empupement est fonction de la quantité d'ecdystéroïdes injectée à des abdomens ligaturés de Musca domestica. Une observation précise des abdomens permet d'apprécier le % de la surface abdominale présentant une cuticule brune, et d'attribuer ainsi un score compris entre 0 (pas de trace de cuticule brune) à 1 (cuticule entièrement brune). Un tel dosage s'avère plus précis que le test Calliphora d'origine, qui apprécie une réponse de type "tout-ou-rien". (d'après Adelung et Karlson, 1969).

Relativement simple à mettre en oeuvre, le bioessai a toutefois progressivement cédé la place aux méthodes physicochimiques (GC-MS) et aux surtout aux méthodes immunologiques (RIA et, plus récemment, EIA) à partir du début des années 70.

 

 

 

René Lafont
 
Dernières modifications : 28 juin 2005
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