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MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLÉCULES

A-Techniques chromatographiques

6-LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE / MÉCANISMES ET MODALITÉS

6-2-Les différents modes de chromatographie liquide

On dispose d'un grand nombre de modes de chromatographie. Certains ont un champ d'application très large, d'autres au contraire correspondent à des applications très spécialisées.
On distinguera dans ce qui suit :

1 - chromatographie d'adsorption
2 - chromatographie de partage (en phase directe (2A) ou inverse (2B))
3 - chromatographie d'échange d'ions (+ chromatographie ionique)
4 - chromatographie de paires d'ions
5 - chromatographie d'exclusion (séparation selon la taille)
6 - chromatographie d'affinité
7 - chromatographie adaptée à la séparation d'énantiomères

Le choix de tel ou tel mode obéit à des règles logiques directement liées à la nature des composés à séparer :

6-2-1-La chromatographie d'adsorption

C'est la première chromatographie réalisée : séparation des pigments végétaux par adsorption sur de la craie (Tswett 1906).

Définition : Ce mode de chromatographie met en jeu un mécanisme d'adsorption du soluté sur la phase stationnaire solide et un mécanisme d'élution (désorption) par la phase mobile liquide ou gazeuse (éluant).

Principe :

- L'adsorption est la fixation plus ou moins énergique d'un gaz, d'un liquide ou d'un soluté sur une surface solide; elle met en jeu des liaisons à faible énergie (liaisons hydrogène, interactions électrostatiques...). Pour être utilisable à des fins séparatives, l'adsorption doit être réversible.

- L'élution ou désorption consiste à extraire le soluté adsorbé à l'aide d'un solvant appelé éluant.

- Les différents solutés sont plus ou moins adsorbés sur la phase stationnaire, et plus ou moins solubles dans la phase mobile; il en résulte une migration différentielle des solutés en fonction de la résultante entre les deux forces (de rétention et d'entraînement) et donc une séparation de ces solutés.
Le schéma ci-après résume les interactions entre le soluté, le solide adsorbant et l'éluant :

 

Adsorbants :
- Les adsorbants doivent être insolubles dans le solvant et chimiquement inertes vis-à-vis du solvant et des solutés.
- Leur granulométrie varie entre 5 et 100 Ám et leur surface spécifique de 50 à 1000 m2/g,
- L'activité d'un adsorbant dépend de sa nature et de sa teneur en eau.

N. B. Dans certains cas, on cherche à diminuer l'activité adsorbante, et on fait au contraire une désactivation.

-La capacité d'adsorption peut être :

- faible (carbonate de calcium...)
- forte (silice, alumine, charbon ...)

-La polarité peut être

- faible (charbon...)
- forte (silice SiO2, utilisée sous forme hydratée : gel de silice, qui présente des fonctions "silanol" : Si-OH , alumine Al2O3, n H2O...)

Solvants :
On utilise généralement des mélanges de solvants, de polarité voisine de celle des solutés à séparer (ceux-ci doivent être solubles dans l'éluant !). On classe les différents solvants selon leur "force éluante" qui traduit leur polarité:

Série éluotrope sur alumine de quelques solvants, classés par ordre de polarité croissante :

solvant

force éluante

solvant

force éluante

Ether de pétrole

0,01

Acétone

0,56

Hexane

0,01

Dioxane

0,56

Cyclohexane

0,04

Butanol

0,56

Tétrachlorure de carbone

0,18

Acétate d'éthyle

0,58

Ether isopropylique

0,28

Acétonitrile

0,65

Toluène

0,29

Pyridine

0,71

Benzène

0,32

Diméthylsulfoxyde

0,75

Ether éthylique

0,38

Isopropanol

0,82

Chloroforme

0,40

Ethanol

0,88

Chlorure de méthylène

0,42

Méthanol

0,95

Dichloroéthane

0,49

Eau

> 0,95

   

Acide acétique

> 0,95

Selon la nature des composés à séparer, on choisit des solvants de force éluante (o) appropriée. C'est rarement un solvant pur, mais en fait un mélange de 2 à 4 solvants, optimisé par tests successifs vis-à-vis des composés étudiés, sans que cela obéisse à des règles permettant de prédire les résultats. Des abaques permettent de calculer la force éluante d'un mélange binaire :

 

Dans les mélanges contenant plus de deux solvants, les derniers sont présents dans de très faibles proportions (< 2%) et correspondent à des solvants de forte polarité (eau, acide) destinés à améliorer la symétrie des pics. Le choix du solvant doit obéir à certaines contraintes :

- miscibilité des composantes élémentaires
- compatibilité avec le système de détection ("cut-off" en UV)*

* N.B. Cette contrainte n'existe pas avec la chromatographie sur couche mince, pour laquelle le choix des solvants est donc plus étendu.


Applications :

La chromatographie d'adsorption est utilisée pour séparer des molécules organiques de masse molaire 100 à 1000 g/mol et de polarité moyenne;

-les molécules apolaires sont pas ou peu retenues, et sont éluées les premières (= elles migrent au front en CCM).
-Les molécules trop polaires risquent d'être adsorbées de façon irréversible, et ne sont donc pas éluées (= elles resteraient sur la ligne de dépôt en CCM).

Exemples :

- lipides : stérols et stéroïdes, caroténoïdes, phospholipides...
- pigments, médicaments...
- oses et oligosides, acides aminés et oligopeptides

L'utilisation de ce mode de chromatographie est assez large, en raison de sa facilité d'emploi et du fait que la transposition depuis la chromatographie sur couche mince est très aisée.

6-2-2-La chromatographie de partage

La chromatographie de partage (ou chromatographie liquide-liquide) met en jeu un mécanisme de partition entre solvants que constituent respectivement par la phase stationnaire et la phase mobile. La phase stationnaire peut être constituée par un film liquide (non miscible avec la phase mobile bien sûr) imprégné sur un support rigide (silice) ou fixé par liaison covalente (phases greffées). C'est ce second type qui est utilisé actuellement. Le greffage est réalisé par établissement de ponts siloxane (Si-O-Si) :

->Si-OH + X-Si(CH3)2-R --> ->Si-O-Si(CH3)2-R + HX

Selon la nature des radicaux R, on distinguera :

- les phases greffées polaires (-diol, -cyanopropyl, aminopropyl,…)
- les phases greffées apolaires (-alkyl, -phényl, …)

Les premières sont utilisées avec des solvants peu polaires (cf adsorption) et permettent de réaliser de la chromatograhie en phase normale ou directe.
Les secondes s'emploient avec des solvants polaires et l'on a alors de la chromatographie en phase inverse ou réverse.
En première approximation, l'ordre d'élution des composés est inversé entre les deux modes, les composés polaires étant élués en premier dans les systèmes en phase réverse.

LES PHASES GREFFEES POLAIRES
Elles s'utilisent comme les colonnes de silice précédentes. La présence de fonctions particulières sur le greffage (-CN, -NH2,…) peut apporter une sélectivité intéressante. De plus, il est possible de travailler avec un gradient de force éluante, donc d'analyser en une seule fois des mélanges contenant des composés de polarités très différentes. Il n'y a pas de phénomènes d'adsorption irréversible et on peut rincer les colonnes avec des solvants très éluants comme du méthanol pur.

LES PHASES GREFFEES APOLAIRES
Ce sont les supports les plus couramment utilisés, principalement avec un greffage alkyl (octadécylsilane ou -ODS ou -C18). Dans ces systèmes, le solvant le plus polaire (l'eau) est le moins éluant et la force éluante de la phase mobile est augmentée par ajout d'un solvant organique (méthanol, acétonitrile).
La phase stationnaire (type de greffage, taux de greffage, porosité) et la phase mobile (type de solvant organique, pH, température,…) concourent toutes deux à la sélectivité de l'ensemble et les possibilités sont innombrables, ce qui explique la popularité de ce mode chromatographique.
Le contrôle de pH permet de faire varier à volonté le k' des composés ionisables. Il convient dans le cas de greffage sur silice de rester dans des limites compatibles avec la non-dissolution de la colonne ( 2 < pH < 8 ). Il existe par ailleurs des phases greffées sur des résines polymérisées qui n'ont pas cet inconvénient et permettent de travailler dans une gamme de pH bien plus large (1-13).
Certains greffages comme le greffage -CN ont des propriétés hybrides qui permettent de les utiliser aussi bien en phase directe qu'en phase inverse.

6-2-3-La chromatographie d'échange d'ions

Définitions : Dans la chromatographie d'échange d'ions, la phase stationnaire comporte des groupements ionisés (+ ou -) fixes; des ions mobiles de charge opposée assurent l'électroneutralité. Les ions retenus au voisinage des charges fixes sont échangeables avec les ions présents dans la phase mobile.

La séparation est basée sur cette propriété d'échange d'ions et ne peut donc s'appliquer qu'à des solutés ionisables.

Les échangeurs d'ions :

Nature :
La phase stationnaire est constituée d'un support insoluble dans l'eau, sur lequel sont greffés des groupements fonctionnels ionisables.

 

-Les supports peuvent être :

• minéraux : silice
• organiques : résine polystyrénique, cellulose, dextrane

-Les groupements fonctionnels sont fixés par des liaisons covalentes sur la matrice; ils sont de deux types :

• les échangeurs de cations portent des groupements chargés (-)
• les échangeurs d'anions portent des groupements chargés (+)

Exemples :

ECHANGEURS DE CATIONS

ECHANGEURS D'ANIONS

FORTS

 

FAIBLES

 

Les échangeurs forts sont ionisés quel que soit le pH, alors que les carboxylates ne le sont qu'à pH > 3 et les amines tertiaires ne sont protonées qu'à pH acide. On utilise les échangeurs d'anions forts pour séparer des acides faibles (ex acides carboxyliques) et les échangeurs faibles pour séparer des acides forts (ex esters phosphate). Le même type de raisonnement s'applique aux échangeurs de cations.
La nature de l'ion échangeable est variable : par exemple une résine cationique peut être utilisée sous forme acide (liée à H+) ou sous forme sodique (liée à Na+); il faut donc conditionner la résine sous la forme ionique adéquate avant son utilisation, et la régénérer après usage.

Caractéristiques :
-Porosité : le support est un polymère plus ou moins réticulé ; la porosité dépend du taux de pontage : un polymère très réticulé a des pores de petite taille et convient pour des petites molécules.
-Granulométrie : le support est commercialisé sous forme de grains de diamètre variant de 30 à 800 Ám (chromatographie basse pression) Celui des colonnes HPLC a une granulométrie de 5-10 Ám (supports totalement poreux) ou légèrement supérieure (supports pelliculaires, en couche de 1 Ám sur des billes de verre). Les échanges sont d'autant plus rapides et efficaces que les grains sont petits.
-Capacité de rétention : c'est la quantité maximale d'ions que peut fixer l'échangeur d'ions, exprimée en mEq/g de poids sec ou en mEq/ml de poids humide. Elle dépend de la densité du support en groupements fonctionnels et il faut en tenir compte pour ne pas trop charger une colonne.

L'affinité d'un échangeur pour un ion donné dépend de plusieurs facteurs:

• de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-même dépend :

L'affinité d'un échangeur pour un ion donné dépend de plusieurs facteurs:

• de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-même dépend :

- de leur nature (pKa)
- du pH de la solution

• de la densité de charge de l'ion considéré, qui dépend:

- de la charge de cet ion c'est-à-dire :
- de la nature de l'ion (pKa, pHi)
- du pH de la solution
- de la taille de l'ion (un ion est d'autant plus fixé qu'il est chargé, ou/et qu'il est petit)

• de la concentration des ions
• de l'accessibilité des groupements fonctionnels ( cf : porosité et granulométrie)

Réaction d'échange d'ions :

 

Le système peut s'écrire : (r = fixé sur la résine; s = en solution)

La constante de sélectivité est donnée par la relation :

et

si > 1 la résine a une affinité préférentielle pour le soluté A

si < 1 la résine a une affinité préférentielle pour le soluté B

Les éluants sont des solutions aqueuses qui contiennent des ions échangeables avec les solutés fixés sur l'échangeur :
-solutions contenant un ion de densité de charge plus élevée et (ou) de concentration plus élevée.
-solutions d'un pH tel qu'il modifie la charge des ions fixés et (ou) des groupements fonctionnels et provoque leur libération dans l'éluat.
On peut éluer avec une solution de composition constante (conditions isocratiques) ou avec un gradient de pH et (ou) de force ionique, pour décrocher successivement les différents ions fixés sur l'échangeur.

Applications : La chromatographie d'échange d'ions est utilisée pour séparer des molécules ionisables, quelle que soit leur taille : ions minéraux, acides aminés, peptides, protéines, nucléotides, acides nucléiques, glucides ionisés et lipides ionisés.

6-2-4-La chromatographie de paires d'ions

On appelle paire d'ions une entité formée par l'association de deux ions de charge opposée. La paire d'ions a donc une charge nette nulle et peut dans ce cas présenter des propriétés ▒ hydrophobes qui permettent de l'analyser par sur une colonne de chromatographie en phase inverse.
Pour arriver à cette utilisation, on emploie des phases mobiles qui contiennent un détergent anionique ou cationique. Ces détergents sont des molécules ionisées qui comportent par ailleurs des chaînes carbonées hydrophobes (ex tétrabutylammonium, laurylsulfonate,…) et forment avec les composés à séparer des paires d'ions hydrophobes.
On peut dans ce mode chromatographique jouer sur un très grand nombre de paramètres :

- nature et concentration du détergent
- pH et force ionique du tampon
- température
- modifiant organique (alcool, acétonitrile,…)

De tels systèmes s'avèrent plus performants (N) que les systèmes d'échange d'ions et ont des capacités plus grandes ( = ils permettent d'injecter de plus grandes quantités d'échantillon sur une colonne de même dimension).

6-2-5-La chromatographie d'exclusion

La chromatographie d'exclusion est aussi appelée FILTRATION SUR GEL ou TAMISAGE MOLECULAIRE. Cette technique est apparue en 1959 avec un produit nouveau : le Sephadex.
Le Sephadex est un gel de dextrane (polymère de glucose a-1-6 produit par Leuconostoc mesenteroïdes), auquel on fait subir une réticulation. Il se présente sous forme de billes poreuses, dont la porosité dépend du degré de réticulation. Ces billes sont très hydrophiles et gonflent dans l'eau. Il en existe différents types en fonction de la taille des billes et de leur porosité.

Principe de la chromatographie d'exclusion :

 

1 : Dépôt d'un mélange de deux molécules (des grosses et des petites) sur une colonne remplie d'un gel de Sephadex.
2 : Les petites molécules peuvent pénétrer dans les billes de Sephadex car leur diamètre est inférieur à celui des pores du gel. Les grosses molécules ne le peuvent pas en raison de leur grande taille; elles sont donc exclues du gel (d'où le nom de chromatographie d'exclusion).
3 : Les grosses molécules ont donc un trajet plus court à parcourir pour arriver en bas de la colonne; elles sont donc éluées les premières.
4 : Les petites molécules sont éluées ensuite car elles ont une plus grande distance à parcourir pour arriver en bas de la colonne.

D'une façon plus générale :

-Les molécules de taille supérieure à celle des pores des billes de Sephadex sont totalement exclues du gel et ne se répartissent que dans le volume extérieur aux billes, c'est-à-dire dans la phase mobile (éluant). Elles sortent les premières, à un volume d'élution Vo appelé volume mort de la colonne.
-Les molécules de taille inférieure à celle des pores des billes de Sephadex peuvent pénétrer librement dans les billes et se répartissent dans l'ensemble des liquides de la colonne (volume de liquide à l'intérieur des billes ou phase stationnaire + volume de liquide à l'extérieur des billes ou phase mobile). Elles sortent donc les dernières, à un volume d'élution Vt ou volume total des liquides de la colonne.
-Les molécules de taille intermédiaire pénètrent un peu dans les billes, en fonction de leur taille et de leur forme; elles pénètrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses, et elles sont éluées dans l'ordre des masses molaires décroissantes.

 

 

 

 

 

1 : Les molécules de masse molaire faible sortent toutes à Vt.
3 : Les molécules de masse molaire élevée sortent toutes à Vo.
2 : Les molécules de masse molaire intermédiaire sortent à des Ve intermédiaires et sont effectivement séparées.

Applications de la chromatographie d'exclusion :

-Cette technique est très utilisée pour la séparation ou l'élimination de sels ou de petites molécules dans les solutions protéiques : DESSALAGE, ECHANGE de TAMPONS ...
-Cette technique est également appliquée au FRACTIONNEMENT de MELANGES de MACROMOLECULES et à la DETERMINATION (approximative) de la MASSE MOLAIRE des protéines. Dans ce dernier cas, il faut d'abord étalonner la colonne avec des protéines de masse molaire connue, tracer la courbe Ve = f(logM), puis effectuer une détermination graphique.

Ce qui précède concernant le Sephadex est en fait très général et s'applique à de nombreux supports, en particulier des supports à base de silice ou de polymères organiques rigides, qui permettent l'utilisation de ces supports en HPLC (ce n'est pas le cas du Sephadex). Ces colonnes, le plus souvent de taille réduite par rapport aux précédentes, mais également plus résolutives et donnant des séparations plus rapides (car autorisant l'emploi de débits linéaires beaucoup plus élevés) sont utilisées à des fins analytiques :

- avec des phase mobiles aqueuses pour les macromolécules biologiques (essentiellement protéines) et avec des phases stationnaires conçues pour minimiser les phénomènes d'adsorption et de dénaturation.
- avec des phases mobiles organiques pour l'analyse des polymères en chimie organique (ex polystyrènes).

 

6-2-6-La chromatographie d'affinité

Ce mode de chromatographie connaît depuis 1970 un développement sans précédent et est appelé à prendre une place encore plus grande avec l'essor des biotechnologies.

Le principe consiste à utiliser une phase stationnaire constituée d'un support (silice, polymère) sur lequel on a greffé une molécule organique particulière qui présente une affinité sélective pour certains constituants d'un mélange dont on cherche à les isoler. Ceux-ci vont être sélectivement adsorbés ou tout au moins retenus sur la colonne, tandis que les autres composants sont très rapidement élués. Un changement de la phase mobile (pH, force ionique ou ajout d'un compétiteur) permet ensuite d'éluer les substances intéressantes, avec un facteur de purification pouvant atteindre 1000.

La chromatographie d'affinité s'utilise avec des colonnes basse pression ou des supports à haute performance (HPLAC). Nous allons illustrer cette technique avec quelques exemples très classiques ou moins courants.

Techniques en basse pression :

- isolement des ARNm polyA+ sur colonne d'oligodT- ou polyU- sepharose à partir d'un extrait d'ARN total (les ARNm représentent 1% du total)
- purification de récepteurs hormonaux avec des colonnes sur lesquelles on a fixé des molécules d'hormones
- à un degré de spécificité très inférieur, les colonnes sur lesquelles sont greffées des ions boronate ont une affinité pour les diols cis et permettent de fixer entre autres les sucres.

Techniques en haute pression (à titre d'exemple) On donnera ici comme exemple le choix offert par un fabricant (Pierce Eurochemie) :

Type de phase stationnaire

Type d'application

Protéine A (de Staphylococcus aureus)

Immunoglobulines

Bleu Cibacron

Enzymes (ex. déshydrogénases)

Boronates (affinité pour diols 1,2 ou 1,3)

Nucléosides, nucléotides, ARNt, Glycoprotéines, sucres

Concanavaline A (lectine)

Glycoprotéines, sucres

Trésyle activé (pour faire sa colonne)

Sert à fixer amines primaires et thiols

 

6-2-7-Techniques pour la séparation d'énantiomères

La séparation d'isomères optiques est un problème qui se pose souvent en biologie, où beaucoup de molécules possèdent un (ou plusieurs) carbone(s) asymétrique(s) : exemple des acides aminés, des hydrocarbures insaturés,...
La synthèse chimique, pour sa part, conduit souvent à des mélanges d'isomères qu'il faut ensuite de séparer afin d'isoler le composé biologiquement actif (exemple des phéromones). Or ces substances ont des propriétés chimiques souvent très voisines et ne sont que mal séparées par les techniques de chromatographie liquide conventionnelles. On a recours alors à des méthodes plus sophistiquées qui font souvent appel à l'utilisation de substances optiquement actives, soit dans la constitution de la phase stationnaire, soit mises en solution dans la phase mobile. Nous nous bornerons ici à donner quelques exemples, les possibilités étant en fait très nombreuses.

Séparation des aminoacides D et L

Le mode de chromatographie utilisé est celui dit de "l'échange de ligandes". On met à profit l'existence d'une formation de complexes entre les métaux de transition (Cu, Zn, Cd, Ni) et les aminoacides.

- dans le mode statique, la phase stationnaire est greffée avec de la L-Proline par l'intermédiaire d'un bras et forme un complexe avec des ions Cu++. Cette structure qui comporte deux carbones asymétriques est hautement stéréosélective et interagit de façon très différente avec les aminoacides des séries D et L, qui sont donc retenus de façon très distincte.

- dans le mode dynamique, la phase stationnaire est un échangeur de cations et contient des ions Cu++ ainsi que de la L- ou D-proline. Les complexes formés sont retenus différemment des formes non complexées, et ceci a pour conséquence de séparer les formes D et L des aminoacides injectés sur la colonne.

Séparation d'isomères en utilisant des complexes d'inclusion

Cette méthode utilise des cyclodextrines (polyosides cycliques formés de 6, 7 ou 8 unités glucose) formant une structure torique au sein de laquelle certaines molécules peuvent s'inclure de façon réversible et d'une façon qui dépend fortement de leur structure spatiale.

- dans le mode statique, la méthode utilise des phases greffées avec des cyclodextrines

- dans le mode dynamique, on dissout une cyclodextrine dans le solvant.

Dans un certain nombre de cas, cette méthode s'avère très efficace pour séparer des isomères.
Ce mode de chromatographie est encore peu utilisé, mais il est en fait assez récent (surtout l'usage des cyclodextrines) et son utilisation devrait se développer assez rapidement.

 

 

 

 

 

 

 

René Lafont
 
Dernières modifications : 28 juin 2005
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