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MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLÉCULES

A-Techniques chromatographiques

6-LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE / MÉCANISMES ET MODALITÉS

Un chromatographe se compose de plusieurs parties. L'élément central est représenté par la colonne, qui effectue la séparation des différents composés. Cet élément vital ne représente toutefois que 1 à 2% du prix du système complet.

Ce système comprend :

- en amont 1 ou plusieurs pompes et un injecteur
- en aval 1 ou plusieurs détecteurs (universels ou spécifiques)

Il existe donc de très nombreuses variantes adaptées aux besoins (ou au budget) des utilisateurs :

- systèmes dits isocratiques ou au contraire capables de former des gradients de solvants (ceci sera abordé plus loin)
- détecteurs très variables, plus ou moins sensibles, plus ou moins spécifiques, plus ou moins sophistiqués. Dans ce domaine le choix est très vaste mais en fait la plupart des utilisateurs possèdent des détecteurs UV ou des spectrophotomètres (UV ou UV-VIS). Parmi les détecteurs sophistiqués on peut retenir :

+ détecteurs à barrettes de diodes (mesure multi-longueurs d'onde continue)
+ détecteurs de radioactivité en flux continu
+ spectromètres de masse, spectromètres RMN

Détecteur

Utilisation

Limite de détection

Linéarité

Réfractomètre

Universelle

Environ 700 ng/ml

3000

UV fixe (254 nm)

Sélective

Environ 0,3 ng/ml

10000

Spectro UV-VIS

Sélective

Environ 0,3 ng/ml

1000

Fluorimètre

Sélective

Environ 0,008 ng/ml

1000 à 10000

Electrochimique

Sélective

Environ 0,001 ng/ml

Conductimétrique

Sélective (ions)

Jusqu'à 0,2% de différence
de conductibilité entre 2 substances

env. 100000

Réacteur post-colonne

Sélective

voir UV ou fluoresrence

voir UV ou fluoresrence

Spectromètre de masse

Sélective

Varie selon les composés

Radioactivité

Analyses métaboliques

Varie selon les isotopes

env. 10000

Les domaines d'application de la chromatographie liquide sont très variés et cette technique représente un outil très largement répandu, qui est utilisé aussi bien pour la séparation des ions minéraux, des petites molécules organiques que celle des macromolécules (protéines, polynucléotides, polymères organiques). Il existe pour chaque catégorie de substances un ou plusieurs modes chromatographiques appropriés. A chacun de déterminer lequel convient le mieux pour le travail qu'il désire effectuer !

Il existe en fait des règles générales simples, qui permettent un choix raisonné du mode chromatographique approprié; elles sont fondées sur des paramètres tels que la taille, la polarité et la charge des composés à analyser.

6-1-Les performances des colonnes

Les performances des colonnes sont exprimées en fonction de deux paramètres fondamentaux :

• le NOMBRE DE PLATEAUX THEORIQUES = EFFICACITE (il exprime la finesse des pics des composés sortant des colonnes)
la SELECTIVITE = l'aptitude du système utilisé à distinguer, donc à séparer les composés injectés.
Pour qu'une séparation soit efficace (= RESOLUTION élevée) il faut bien sûr optimiser simultanément les deux paramères précédents.

EFFICACITE : N

Elle est exprimée en nombre de plateaux théoriques (N), chiffre calculé à partir du temps de rétention (tr) et de la largeur du pic (w) ou la largeur du pic à mi-hauteur (w1/2) selon l'équation :

N = 16(tr /w)2 = 5,54 (tr /w1/2)2
Le nombre de plateaux pour les colonnes actuelles (remplies avec des particules de 5 Ám de diamètre) est de 80.000 à 100.000 par mètre soit 20 à 25000 pour une colonne de 25 cm de long (longueur standard).

 

Il est possible de calculer un nombre de plateaux efficaces (N'), obtenu en remplaçant dans les équations précédentes le temps de rétention tr par le temps de rétention réduit t'r = (tr - to ); bien sûr N' est < N, mais c'est une mesure plus objective de l'efficacité.
N (ou N') n'est pas une constante caractéristique de la colonne, mais n'est valable que pour un solvant et un (ou un groupe de) composé(s) donné(s). Les chiffres donnés plus haut sont en fait un optimum.
On définit également un facteur de symétrie des pics. En théorie les pics devraient être des gaussiennes symétriques (dans des conditions thermodynamiques optimales). En pratique ce n'est pas souvent le cas. On calcule le facteur de symétrie par le rapport a/b des demi-largeurs à 10% de la hauteur total du pic : on a en principe 0,85 < a/b < 1,3.

 

SELECTIVITE :
Pour calculer ce facteur, on doit tout d'abord définir un premier paramètre, le facteur de capacité k':

[N.B. : le facteur de capacité k' est facile à relier au Rf obtenu en couche mince, et l'on peut facilement démontrer que k' = (1/Rf ) - 1.

Ceci permet de transposer les résultats de la CCM à la HPLC
Le facteur de sélectivité , qui mesure l'aptitude de la colonne à séparer les composés 1 et 2 est égal à :

Les valeurs de sont en général comprises entre 1,05 et 2. Si la colonne est efficace (N élevé), des valeurs supérieures ne sont pas nécessaires.

RESOLUTION : R
Le but de la chromatographie est bien évidemment de séparer les composés. L'efficacité de cette séparation est appréciée par le paramètre appelé résolution R :

Deux composés sont séparés si la différence de leurs temps de rétention est supérieure ou égale à la somme des demi-largeurs des pics (R > ou = à 1). En fait, étant donnée la forme des pics (des gaussiennes) pour R = 1 il y a 2% de recouvrement des composés. Une séparation totale nécessiterait R > ou = à 1,5.
En combinant les différentes équations précédentes, on peut exprimer la résolution sous la forme :

 

 

Cette relation comporte trois termes, soit :
- l'efficacité N
- la sélectivité
- le facteur de capacité k'

On peut/doit jouer sur ces trois termes pour réaliser une séparation de deux composés.
(1) en utilisant des colonnes plus performantes (N élevé) et plus longues (mais attention, car on est limité par la pression);
(2) en prenant des solvants peu éluants (k' élevé) mais il ne sert à rien d'aller au-delà de k' = 10; ceci augmente la durée des analyses;
(3) en choisissant avec discernement une colonne et un solvant appropriés, c'est-à-dire en jouant sur la sélectivité (c'est le point le plus important et c'est là qu'intervient l'expérience de l'utilisateur).

 

René Lafont
 
Dernières modifications : 28 juin 2005
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