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MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLÉCULES

A-Techniques chromatographiques

2-CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHES MINCES (CCM)

Cette méthode est assez ancienne (+ de 50 ans) et relativement peu performante, mais elle continue à être très utilisée car :

- elle ne nécessite pas un appareillage sophistiqué
- son coût de revient est très faible
- elle offre la possibilité de traiter rapidement un grand nombre d'échantillons (pour des analyses de routine).

Elle a presque totalement remplacé la chromatographie sur papier en raison de ses performances plus élevées. Toutefois, certaines applications spécifiques peuvent encore s'avérer plus intéressantes avec cette dernière technique, bien que la CCM (également appelée TLC pour thin-layer chromatography) offre en fait bien des possibilités actuellement. De plus, de nouveaux supports plus performants (composés de microparticules) sont récemment apparus sur le marché (--> HPTLC) et offrent des efficacités notablement accrues.

Les supports utilisés sont variés :

• silice, cellulose,
• support imprégné ou greffé (phase inverse)
• échangeurs d'ions,
• micro-supports (HPTLC)

L'analyse est qualitative ou quantitative.

Dans le cas de solutés incolores, il est nécessaire de visualiser les spots par une réaction colorée (qui peut être générale ou spécifique) ou par fluorescence; c'est la révélation.
L'identification des constituants du mélange se fait par comparaison avec des témoins, en calculant le Rf (rapport au front) de chaque soluté, ou encore le Rt (rapport à un témoin) lorsque le solvant a dépassé le niveau supérieur de la plaque.

 

Résultats obtenus après développement et révélation

Calcul du rapport au front (Rf ou "réference front")

L'analyse qualitative peut faire appel à un appareillage sophistiqué, qui permet de déterminer par exemple le spectre d'absorption, de fluorescence ou de masse de chaque spot.
On peut également effectuer une analyse quantitative des spots, par planimétrie (évaluation de la surface du spot, dont le log est proportionnel à la quantité de soluté), par élution (découpage ou grattage puis mise en solution dans un solvant approprié et dosage colorimétrique), ou par densitométrie (mesure directe de l'absorbance du spot sur la plaque par des appareillages plus ou moins automatisés). On peut également mesurer la radioactivité grâce à un détecteur approprié.

 

René Lafont
 
Dernières modifications : 28 juin 2005
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