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MÉTHODES PHYSIQUES DE SÉPARATION ET D'ANALYSE ET MÉTHODES DE DOSAGE DES BIOMOLÉCULES

A-Techniques chromatographiques

1-GENERALITES

Le terme de "chromatographie" a été crée par Mikhail TSWETT en 1905, pour décrire une technique de séparation de pigments végétaux (chlorophylles et caroténoïdes) sur des colonnes remplies d’une substance adsorbante. Il évoque donc la couleur des substances analysées, mais il est possible que l’origine du nom soit tout autre : en effet, le nom de l’auteur signifie "couleur" en russe, et il est donc possible que ce dernier ait voulu donner son nom à la technique qu’il avait mise au point (Jaussaud, 1996). Les méthodes chromatographiques regroupent des techniques très variées qui peuvent être classées selon trois modalités différentes :

Classification selon la nature physique des phases
Classification selon le phénomène mis en oeuvre
Classification selon le procédé opératoire.

1-1-Classification selon la nature des phases :

• la phase mobile est un fluide, donc soit un liquide, soit un gaz (soit encore un fluide "supercritique")
• la phase stationnaire est soit un solide, soit un liquide.

La combinaison de ces possibilités conduit à diverses possibilités :
• chromatographie liquide—solide (cas de Tswett) (LSC)
• chromatographie liquide—liquide (LLC)
• chromatographie gaz—solide (GSC ou GC)
• chromatographie gaz—liquide (GLC ou GC)
• la chromatographie supercritique (SFC)

La SFC représente un cas intermédiaire entre LC et GC, les fluides supercritiques possédant des propriétés à la frontière entre celles des liquides et celles des gaz.

1-2-Classification selon le phénomène chromatographique :

Ce dernier dépend de la nature (et de la structure) de la phase stationnaire utilisée. On distinguera donc :

• la chromatographie d'adsorption (LSC, GSC) (lorsque la phase stationnaire est un solide); par extension on
pourrait y rattacher la chromatographie d'affinité, qui correspond à un cas où les propriétés d'adsorption de la phase stationnaire sont spécifiques vis-à-vis d'un (ou une famille de) composé(s).
• la chromatographie de partage (LLC, GLC), lorsque la phase stationnaire est un liquide non miscible avec la phase mobile (mise en jeu de coefficients de partage).
• la chromatographie d'échange d'ions (IEC), où la phase stationnaire porte des groupes fonctionnels acides ou basiques, destinée à séparer des composés ionisés.
la chromatographie d'exclusion (SEC) où la phase stationnaire (poreuse) se comporte comme un tamis et sépare les composés en fonction de leur taille; on parle aussi de chromatographie de perméation de gel (GPC).

1-3-Classifications selon les procédés utilisés :

Selon le conditionnement de la phase stationnaire, on distinguera :

• la chromatographie sur colonne (y compris systèmes à contre-courant)
• la chromatographie sur papier
• la chromatographie sur couche mince.

Selon les modalités de migration de la phase mobile, on distinguera

• la chromatographie par développement (les constituants de l'échantillon restent sur la phase stationnaire)
• la chromatographie d'élution (les substances sont entraînées hors de la phase stationnaire).

Les méthodes chromatographiques, bien que très diverses, mettent en jeu un certain nombre de principes communs :
- les substances se répartissent entre deux phases non miscibles, selon un équilibre lié à un coefficient de partition, qui dépend à la fois de la nature des composés et de celle des deux phases considérées;
- le renouvellement continu de la phase mobile remet en cause cet équilibre et entraîne une succession d'autres équilibres, ce qui se traduit par une migration des substances le long de la phase stationnaire;
- la séparation est obtenue car chaque composé migre avec une vitesse qui lui est propre (et dépend du coefficient de partition décrit ci-dessus).

René Lafont
 
Dernières modifications : 28 juin 2005
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