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LE CLONAGE CHEZ LES AMPHIBIENS

Christian Aimar

 

Le clonage est l'une des applications de la technique de la greffe de noyaux mise au point sur les amphibiens par deux biologistes américains T.J. King et R. Briggs en 1952.
Historiquement, les premières expériences de clonage furent réalisées chez le xénope (amphibien anoure) par le biologiste anglais J.B. Gurdon en 1962, puis chez le pleurodèle (amphibien urodèle) en 1966 par Christian Aimar (Université Pierre et Marie Curie).
Chez les mammifères, le premier clonage  à partir de noyaux d'adultes, fut obtenu chez le mouton par Wilmutt et ses collaborateurs en 1977.

PRINCIPE GENERAL

Obtention d'individus génétiquement identiques par la technique de greffe de noyaux (greffe nucléaire). Les noyaux proviennent de cellules diploïdes d'un même animal et sont injectés dans des ovocytes énucléés issus d'une femelle de la même espèce.

 
Protocole applicable à l'amphibien Pleurodèle (Urodèle)
- Préparation des cellules donneuses de noyaux
Les cellules utilisées peuvent être des cellules somatiques ou germinales issues de tissus d'embryons ou d'adultes. Les tissus sont prélevés et placés dans un liquide physiologique favorisant la séparation des cellules (milieu dépourvu des ions calcium et magnésium, additionné d'agents dissociants cellulaires).


Dissociation des cellules d'une blastula: au centre les cellules endodermiques, en périphérie, les cellules ectodermiques pigmentées.

-Préparation des ovocytes
Ils proviennent de femelles adultes stimulées par hormone gonadotrope hypophysaire. La ponte s'effectue de 24 à 48 heures après l'injection hormonale. Des cordons de la ponte sont placés dans des coupelles contenant du liquide physiologique. Les gangues gélatineuses protectrices entourant les oeufs sont éliminées manuellement à l'aide de deux pinces fines, ou par traitement chimique (action de protéases).
 
Chez l'amphibien, les "oeufs" pondus sont des ovocytes dont les noyaux femelles sont bloqués au stade métaphase II de la méiose. Il convient de neutraliser le génôme des ovocytes : c'est le rôle de l'énucléation et de relancer les activités métaboliques qui permettront à terme le développement embryonnaire : c'est le rôle de l'activation.
 
 
 
 
Enucléation
Le noyau femelle étant situé à l'apex (pôle animal) de l'ovocyte sous la membrane plasmique, la piqure d'une aiguille de verre pratiquée à cet endroit provoque l'expulsion du noyau et celle d'une faible quantité de cytoplasme. Plus aisément, une exposition de l'apex des ovocytes à une irradiation aux rayons ultra-violets (UV) de 90 secondes induit une microfragmentation de l'ADN de leurs noyaux ce qui entraîne leur inactivation par dégénérescence.

Ovocyte secondaire dégangué prêt à être énucléé et activé. A l'apex, la métaphase de 2nd division de méiose est visible par transparence (flèche) au centre d'une aire de cytoplasme superficiel non pigmenté (tache de maturation).
 
 
Activation
 
Dans une coupelle contenant du liquide physiologique, les ovocytes sont disposés en ligne entre deux électrodes reliées à un condensateur. Une décharge de 50µF sous 70V, mimant l'action du spermatozoïde, provoque la dépolarisation de la membrane plasmique des ovocytes qui déclenchera le processus d'activation.
 
 


Ovocyte activé par décharge électrique. La tache de maturation s'estompe, le noyau a migré en profondeur dans le cytoplasme tout en achevant sa division méiotique et sa transformation en un pronucléus femelle haploïde (non fonctionnel car préalablement inactivé par les rayons UV).

AU TERME DE CETTE PRÉPARATION, LES OVOCYTES N'ONT PLUS DE NOYAU FEMELLE FONCTIONNEL. ILS SONT ACTIVÉS ET APRES INJECTION D'UN NOYAU DIPLOÏDE PEUVENT ENGAGER, COMME DES OEUFS FÉCONDÉS, LES PREMIÈRES PHASES DU DÉVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE (PAGE SUIVANTE).

 

 

 

Dernière modification : 12 décembre 2005
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