Ce sont les expériences de Calvin (1952) et Bassham et Calvin (1959) qui ont permis de connaître la nature du premier composé carboné formé par la photosynthèse.

Expérience de Calvin, protocole expérimental. En fonction du débit de la pompe, on est capable très précisément de calculer le temps pendant lequel les chlorelles situées dans le serpentin ont été en contact avec le CO2 radioactif avant d'être fixées par le méthanol bouillant.

Après incubation pendant un temps variable en présence de C0₂ à la lumière, la suspension de chlorelles est fixée rapidement par l'éthanol bouillant Cet extrait est traité de la manière suivante :

• séparation des constituants par chromatographie bidimentionnelle à l'aide de deux mélanges successifs (1-eau/phénol puis 2-butanol/acide propionique) ;
• révélation du chromatogramme par différents colorants spécifiques (acides organiques par le bleu de bromophénol, acides aminés par la ninhydrine, sucres par le naphtorésorcinol et composés phosphorylés par le molybdate d'ammonium).

Expérience de Calvin chromatographie bidimentionnelle des composés. Une chromatographie bidimentionnelle après révélation permet de séparer les différentes substances solubles présentes dans un extrait. (Cette image n'est pas une chromatographie originale mais un schéma explicatif).

• Des chromatogrammes non colorés sont placés contre un film photographique à l'obscurité.
• Après un temps d'exposition, le film est révélé. Les taches indiquent la présence des composés radioactifs qui se sont formés.
• La comparaison des chromatogrammes colorés et des chromatogrammes révélés par autoradiographie permet de savoir quels produits ont été synthétisés au cours du contact avec le ¹⁴CO_2.
  

Expérience de Calvin chromatographie et autoradiographie des composés formés. Trois autoradiographies de chromatogrammes réalisés sur des extraits de chlorelles mis en contact avec le CO2 radioactif pendant 5, 10 et 30 secondes (Ces images ne sont pas des autoradiographies originales mais des schémas explicatifs).

On constate qu'après moins de 5 secondes, c'est un composé en C3, l'APG ou acide PhosphoGlycérique qui est le premier composé formé. Ensuite, se sont des oses bis-phosphates dont un sucre en C5, le Ribulose bis-phosphate ou RUBP) puis la plupart des sucres (trioses phosphate, saccharose, ...), des acides organiques (malate, ...) et des acides aminés (glycine, ...) qui sont marqués.

• L'acide phosphoglycérique (APG) est le premier composé formé et donc est à l'origine de toutes les synthèses.
• On pourrait donc s'attendre à ce que l'accepteur du CO₂ soit un composé en C5. Or un pentose (C5) bisphospate (le RUBP ou Ribulose bis-phosphate) peu connu apparait rapidement dans les radiochromatogrammes. C'est donc lui l'accepteur de CO₂.
• L'acide phosphoglycérique (APG), premier composé formé, n'est pas un sucre. Pour entrer dans les réactions de synthèse des composés organiques, il doit être réduit en trioses phosphate (ald PG ou aldéhyde phospho glycérique) qui apparaissent effectivement rapidement dans les radiochromatogrammes.
• Pour que l'ensemble fonctionne, il faut que le RUBP (qui existe en faible quantité) soit régénéré et ceci ne peut se faire qu'à partir des composés dérivés des trioses phosphate.

L'incorporation du CO₂ se réalise donc de la manière suivante :

Ceci peut se résumer par un cycle : le cycle de Calvin et Benson. Ce cycle comporte trois étapes :

• 1 - l'incorporation du CO₂ dans le RuBP,
• 2 - la réduction de l'APG en trioses phosphate,
• 3 - la régénération du RUBP.

Cycle simplifié de Calvin Benson. Pour fonctionner, il nécessite des intermédiaires énergétiques (ATP et NADPH) produits par la phase photochimique. Le cycle comporte trois étapes essentielles : l'incorporation proprement dite du CO2 , la réduction de l'APG en trioses, puis la régénération du RUBP à partir d'une fraction des trioses formés.

15 - Stucture et fonctionnement de l'ATP synthase

SOMMAIRE

17 - Les étapes du cycle de Calvin