La synthèse d'ATP dans le chloroplaste s'effectue au niveau du complexe ATP synthase (ATPase de type F ou ATPase F1Fo) associée à la membrane du thylakoïde. L'énergie nécessaire à la synthèse de l'ATP est fournie par l'énergie libérée par transfert d'électrons photosynthétiques. Cette synthèse d'ATP dans le chloroplaste à la lumière est appellée photophosphorylation.

Le principe du couplage entre le transfert d'électrons et la synthèse d'ATP repose sur la théorie chimio osmotique émise en 1961 par P. Mitchell. Dans le cadre de cette théorie :

• l'ATP synthase est une enzyme potentiellement réversible qui fonctionne comme une pompe à protons transmembranaire (remarque importante : in vivo elle fonctionne dans le sens de la synthèse),
• la chaîne de transfert d'électrons fonctionne également comme une pompe à protons transmembranaire (pompe dite redox) qui génère une différence de potentiel électrochimique de protons (gradient de protons ou force proton motrice, voir plus loin) de part et d'autre de la membrane du thylacoïde. Cette membrane présente, par ailleurs, une faible conductance naturelle aux protons.
• la synthèse de l'ATP résulte du couplage entre ces deux pompes à protons (redox et ATP synthase). Le gradient transmembranaire de protons joue donc le rôle d'intermédiaire énergétique obligatoire entre le tranfert des électrons et l'ATP synthase.

La vérification de cette théorie nécessite donc de démontrer expériementalement que :

• l'ATP peut être synthétisé à l'obscurité par un gradient de protons artificiel que l'on impose à la membrane du thylakoïde ;
• la chaîne de transfert des électrons délocalise des protons lorsque le thylakoïde est éclairé ;
• la synthèse de l'ATP à la lumière est inhibée par des agents chimiques qui augmentent la conductance membranaire aux protons du thylakoïde (agents dits protonophores qui agissent comme découplants de la photophosphorylation).

Les expériences suivantes vérifient ces principes de base.

1 - L’ATP peut être synthétisé par un gradient de protons artificiel

Expérience "du bain acide" de Jagendorf et Uribe (1966).

Expérience "du bain acide" de Jagendorf et Uribe A partir d'une suspension de chloroplastes, les chloroplastes sont cassés (par choc osmotique par exemple) et les thylakoïdes sont isolés par centrifugation (le stroma a été éliminé). L'ensemble de l'expérience est effectuée à l'obscurité. 1 - cette suspension est placée dans un milieu acide tamponné à pH 4, 2 - après quelques minutes, le pH des thylacoïdes s'est équilibré avec celui du milieu, 3 - on transfère alors les thylacoïdes dans un milieu basique tamponné à pH 8 en présence d'ADP et de phosphate inorganique (Pi) (+ Mg2+). Résultat : un dosage d'ATP dans le mileu de suspension montre qu'il y a eu synthèse d'ATP.

Explication : Cette expérience est effectuée à l'obscurité. Il n'y a donc pas de transfert d'électrons, d'oxydation de l'eau ni aucune participation des photosystèmes.

C'est uniquement la différence de pH (et donc la différence de concentration en H⁺) entre l'intérieur et l'extérieur des thylacoïdes qui a permis la synthèse d'ATP. C'est donc l’efflux de protons (depuis le lumen vers le milieu ) à travers l’ATP synthase qui provoque la synthèse d’ATP.

Gradient de pH et synthèse d'ATP. L e gradient de pH (concentration en H+ entre l'intérieur et l'extérieur du thylacoïde provoque un efflux de protons au niveau de l'ATP synthase et permet la synthèse d'ATP.

2 - La chaîne de transfert des électrons fonctionne comme une pompe à protons.

Des thylakoïdes en suspension dans un milieu faiblement tamponné sont placés dans une cuve thermostatée. Une électrode de pH reliée à un enregistreur est placée dans la suspension qui est agitée continuellement. Une source de lumière blanche permet de faire des transitions obscutité/lumière.
Remarque : dans cette expérience il n'y a ni ADP ni Pi donc aucune synthèse d'ATP possible.

Mouvements des protons à travers la membrane des thylacoïdes. Dispositif pour mesurer les mouvements de protons à travers les thylacoïdes à la lumière (à gauche) et enregistrement des variations de concentrations de protons du milieu de suspension lors de transitions obscurité / lumière (à droite).

Résultats
Les résultats montrent que la lumière provoque une diminution extrêmement rapide de la concentration en protons du milieu. La variation de concentration se stabilise et se maintient constante tant que la source lumineuse reste allumée. Par contre, lors du retour à l'obscurité, la concentration en protons augmente lentement pour atteindre la valeur observée initialement.

On en déduit que le transfert des électrons à la lumière provoque un influx vectoriel de protons à travers le thylakoïde. On constate également que l'entrée (active) des protons à la lumière est extrêmement rapide tandis que la sortie des protons (par diffusion passive) lors du retour à l'obscurité est beaucoup plus lente. Cette diffusion lente traduit la faible conductance de la membrane aux protons.

Expériences complémentaires :

- l'addition d'une faible concentration d'un agent protonophore (comme le CCCP pour carbonyl cyanide phényl hydrazone) à la lumière provoque un retour immédiat à la concentration initiale (sortie extrêmement rapide des protons du thylakoïde) ;

- l'addition de CCCP à l'obscurité empêche les mouvement de protons à la lumière (aucune variation de concentration en protons est observée).

3 - Expression du gradient de protons

En terme énergétique, le gradient de protons généré à travers le thylacoïde à la lumière correspond à une différence de potentiel électrochimique de protons. A ce titre il est constitué de deux composantes : une composante électrique (DY ) et une composante de concentration (DpH ). On peut écrire l'expression :

DmH⁺ = FDY - RTDpH

dans laquelle DY = différence de potentiel électrique transmembranaire en V, DpH = différence de pH. (F est la constante de Faraday, R est la constante des gaz parfaits et T = la température en °K). La valeur de DmH⁺ est alors exprimée en J.mol^-1

Le gradient de protons peut s'exprimer également en unité électrique. On parle alors de force proton motrice qui s'exprime en V :

Dp = DmH+ / F = DY - RT / FDpH

qui devient à 25°C et en mV : Dp = DY - 59 DpH

- Dans le cas des thylakoïdes, en état stationnaire à la lumière, le gradient de protons n'est représenté que par un DpH (en raison d'une perméabilité élevée de cette membrane aux ions Cl^- et Mg²⁺). L'expression de la force proton motrice devient : Dp = - 59 DpH. Le pH du lumen est acide (environ 5) et celui du stroma est alcalin (environ 8). La valeur du DpH est donc de 3 et la force protonmotrice d' environ -180 mV.

En conclusion, à la lumière la chaîne de transfert des électrons génère une force protonmotrice. Cette force dirige un mouvement de protons à travers l'ATP synthase, ce qui permet le fonctionnement de l'enzyme dans le sens de la synthèse (voir ATP synthase).

4 - Transport de protons à travers la membrane du thylacoïde

L'augmentation de la concentration en protons (H⁺) dans le lumen du thylacoïde est réalisée grâce à :
-un transfert vectoriel de protons qui s'effectue au niveau du complexe PQ-cytochrome b6f ;
-la libération des protons due à l'oxydation de la molécule d'eau.

Que se passe-t'il dans le cas d'un transfert acyclique des électrons ?

La quantité de protons délocalisés par la chaîne de transfert d'électrons photosynthétiques n'est pas connue avec précision.

On admet que le transfert des électrons au niveau du complexe b6f conduit à une translocation maximum de 4 protons par paire d’électrons lorsque le cycle Q fonctionne (Remarque 1 : le cycle Q est un mécanisme qui permet de rendre compte d'un transport de 4 H+ par molécule de PQH2 oxydée au niveau du complexe b6f. Remarque 2 : si le cycle Q ne fonctionne pas, seulement 2 protons sont délocalisés à ce niveau). De plus, 2 protons supplémentaires apparaissent dans le lumen (de manière non vectorielle) par paire d’électrons transférés au niveau du système d’oxydation de l’eau .

La quantité de protons apparus dans le lumen par paire d'électrons transferés dans la chaîne est donc de 6 (stoechiométrie H+/2e- = 6).

Remarque importante : Dans la figure, les réactions sont établies pour l'oxydation de 2 molécules d'eau (cf. sytème d'oxydation de l'eau) et donc le transfert de 4 électrons dans la chaîne et la réduction de 2 molécules de NADP+.

Synthèse d'ATP et fonctionnement du thylacoïde. Le transfert d'électrons à la lumière catalyse un influx de H+ dans la lumière du thylacoïde qui génère un gradient de protons. L'efflux spontané des H+ dans le stroma via l'ATP synthase permet la synthèse d'ATP.

Que se passe-t'il dans le cas d'un transfert cyclique des électrons ?

Dans ce cas, seule la transport de protons au niveau du complexe b6f est concerné, ce qui donne une valeur maximale H+/ 2e- = 4.

(Même remarque que précédemment concernant la figure ).

Transfert cyclique des électrons et membrane du thylacoïde. Le transfert ne fait pas intervenir le photosystème II. Il n'y a donc pas oxydation de l'eau (à gauche)et pas de réduction de NADP (à droite). Cependant, en fonction des potentiels redox, les électrons repassent par le système des plastoquinones et des cytochromes b6f. Le couple PQ/pQH2 permet le passage d'ions H+ dans l'espace intrathylacoïdal et provoque un gradient de pH générateur d'ATP.

5 - Rendement des photophosphorylations acyclique et cyclique (ATP / 2e-)

Il est admis que la synthèse d'une molécule d'ATP par l’ATP synthase du chloroplaste nécessite 4 protons (stoechiométrie H+ / ATP = 4, cf. ATP synthase).

En prenant en compte cette valeur et les quantités de protons apparus dans le lumen lors du transferts acyclique ou cyclique des électrons (H+ / 2e-) indiquées précédemment, on peut estimer le rendement optimum de la photophosphorylation (ATP / 2e-) dans ces conditions, sachant que :

ATP / 2e- = [ ATP / H+] x [H+ / 2 e-]

a) Cas du transfert d’électrons acyclique (PSII + PSI)

* le rendement de la photophosphorylation sera : ATP / 2e- = [ATP/H+] . [H+ / 2e-] = 1/4 x 6 = 1,5.

La quantité maximum d'ATP synthétisée lors du transfert d’électrons acyclique est donc de 1,5 par molécule de NADPH formé.

b) Cas du transfert d’électrons cyclique (PSI seul sans formation de NADPH)

* le rendement de la photophosphorylation sera : ATP / 2e- = [ATP/H+] . [H+ / 2e-] = 1/4 x 4 = 1,0.

Au maximum 1 molécule d’ATP est synthétisée dans ces conditions.

Conclusion :

Le chloroplaste assure à la fois la synthèse de NADPH (pouvoir réducteur) et de l'ATP (intermédiaire énergétique) nécessaires à la réduction du C0₂.

13 - Structure et fonctionnement du thylacoïde

SOMMAIRE

15 - Stucture et fonctionnement de l'ATP synthase