Les végétaux possèdent trois types de pigments photosynthétiques, les chlorophylles et les caroténoïdes présents chez tous les végétaux autotrophes au carbone, et les phycobilines présents exclusivement chez les algues et les cyanobactéries.

1 - extraction et séparation des pigments

Les chlorophylles et les caroténoïdes sont solubles dans des solvants organiques et peuvent donc être séparés à l'aide de solvants ou de mélanges de solvants des lipides. Ces molécules sont dites liposolubles.

Extraction des pigments bruts : la feuille est broyée dans de l'alcool absolu ou de l'acétone. Les pigments solubles dans les solvants organiques sont extraits. Après filtration pour éliminer les débris cellulaires, on obtient une solution brute de pigments.

Il est alors possible de séparer les différents pigments de la solution brute. Une méthode simple, essentiellement qualitative, peut être réalisée par une chromatographie sur papier.

Chromatographie sur papier : on dépose une goutte de pigments bruts sur une feuille de papier. On place la feuille de papier dans un récipient hermétique dans lequel on a placé un solvant approprié. Le solvant monte dans la feuille par capillarité en entraînant les pigments de manière différentielle selon leur affinité avec le solvant. On peut distinguer ainsi deux catégories principales de pigments : les chlorophylles (vertes) et les caroténoïdes (jaunes).

Remarque : les pigments extraits ainsi sont purs. Dans la feuille, ils étaient associés à des protéines dans les thylacoïdes des chloroplastes.

2 - spectre d'absorption des pigments bruts

Les chlorophylles et les caroténoïdes absorbent certaines radiations dites actives pour la photosynthèse, dans la gamme de longueurs d'onde visibles comprises entre 500 et 700 nm.
A partir d'une solution de pigments, on peut donc mesurer les caractéristiques d'absorption de la lumière en réalisant un spectre d'absorption à l'aide d'un spectrophotomètre UV visible classique, qui permet de mesurer l'absorption (A) en fonction de la longueur d'onde (l).

Spectre d'absorption des pigments bruts extraits à partir d'une feuille. L'absorption maximale se réalise dans le bleu (< 500nm) et dans le rouge (650-700 nm).

On ne peut dans ce spectre reconnaître la part qui revient à chaque pigment. Pour cela, il faut travailler sur des solutions de pigments séparés et purifiés.

3 - Les chlorophylles et leurs propriétés

Les chlorophylles sont :

• constituées d'un noyau tétrapyrrolique. Les pyrroles I, II, III et IV sont reliés par des ponts méthènyles (- CH -).
• chaque pyrolle possède différents substituants : dans le cas de la chlorophylle a, le pyrrole II possède un -CH₃ qui est remplacé par un -CHO dans le cas de la chlorophylle b.
• les atomes d'azote sont liés à un atome de magnésium par deux liaisons ioniques et deux liaisons de coordination.
• contre le noyau III se trouve un cycle supplémentaire (V) avec une fonction carboxyle estérifiée par le méthanol.
• la fonction carboxyle associée au noyau IV est estérifiée par un alcool à très longue chaîne en C₂₀ : le phytol
• l'ensemble de la molécule de chlorophylle est amphiphile.
• dans la membrane des thylacoïdes, les chlorophylles sont associées à des protéines et forment des complexes protéines - pigments.

Formule des chlorophylles a et b : la chaîne phytol n'a pas été détaillée.

Spectres d'absorption des chlorophylles a et b.

4 - Les caroténoïdes et leurs propriétés

Les caroténoïdes sont des molécules constituées de 40 carbones formés de 8 unités isoprènes.

• Ils possèdent des extrémités cyclisées.
• Le précurseur des caroténoïdes est le phytoètre (molécule linéaire à 40 carbones) qui est synthétisé par condensation de 2 molécules de géramyl pyrophosphate (molécules à 20 C) elles-mêmes synthétisées par condensation de 4 molécules d'isoprène pyrophosphate (molécule à 5 C).
• Le phytoètre subit ensuite des désaturations, des cyclisations à ses extrémités pour former les carotènes. Les carotènes peuvent être ensuite hydroxylés pour donner des xanthophylles.

Formule des caroténoïdes. Un exemple de carotène, le β carotène et de xanthophylle, la lutéine.

Spectres d'absorption des caroténoïdes : ils absorbent dans le bleu et un peu dans le vert (maxima autour de 420, 440 et 460 nm).

5 - Distribution spectrale de l'énergie lumineuse

Les pigments photosynthétiques absorbent la lumière visible, c'est à dire un ensemble de radiations électromagnétiques qui ont des longueurs d'onde comprises entre 400 et 700 nm.
Le domaine visible ne constitue qu'une faible partie de l'ensemble des radiations reçues à la surface terrestre.
Si on se limite à la lumière visible et à l'infrarouge (gamme de longeurs d'onde comprises entre 400 et 1400 nm), le spectre du rayonnement solaire direct est constant et présente un maximum se situant alentour de 600 nm (couleur jaune) tandis que le spectre du rayonnement diffus résultant de la diffusion du rayonnement direct sur les particules et certains gaz (ozone, etc.) de l'atmosphère, présente un maximum se situant dans le bleu.

Distribution spectrale de l'énergie lumineuse (d'après Eckart et al. 1977). Le domaine spectral couvre le domaine du visible (400-700) et de l'infrarouge. Les spectres sont continus. Le spectre du rayonnement direct (courbe jaune) présente un maximum vers 600nm (jaune). Il présente des "creux," (indiqués par les flèches noires), des bandes d'absorption, qui sont dues principalement à l'eau et au dioxyde de carbone dans l'infrarouge, aux poussières et à certains gaz (ozone,etc.) dans le domaine du visible et de l'infrarouge. Le spectre du rayonnement diffus (courbe bleue, présente un maximum dans le bleu. Le spectre d'absorption des pigments bruts d'une plante est représenté en vert.

Les radiations lumineuses correspondent ainsi à un ensemble de photons qui interviennent par leur nombre et leur énergie (donnée par la relation E = hν , conception quantique dans laquelle h est la constante de Planck et ν la fréquence de la radiation lumineuse). Dans le domaine de la photosynthèse on utilise cette conception bien adaptée aux phénomènes photochimiques qui caractérisent ce processus.
L'énergie émise par la source lumineuse est alors exprimée comme un flux de photons (moles de photons .s^-1).
L'énergie lumineuse reçue par la surface éclairée (éclairement) s'exprime alors en moles de photons s^-1 et m^-2.

6 - Comment se comportent les chlorophylles vis à vis de la lumière?

Excitation

• Ce sont les électrons des doubles liaisons conjuguées (électrons délocalisés) du noyau tétrapyrrolique qui sont excités par la lumière.
• A l'obscurité, les électrons sont dans un état non excité (dit fondamental). Ils sont associés par paires, à l'état singulet (spins antiparallèles) et sur une orbitale de faible énergie.
• Il existe 2 états excités principaux de la molécule de chlorophylle, correspondant à des transitions électroniques provoquées par l'absorption d'un photon qui fait passer un électron de l'état fondamental soit à l'état excité supérieur (Sa), soit à l'état inférieur (Sb) selon l'énergie du photon.
  Sa correspond à l'absorption de photons "bleu".
  Sb correspond à l'absorption de photons "rouge".

Désexcitation

Il existe plusieurs façons pour la molécule de chlorophylle de revenir à l'état fondamental.
de l'état Sa à l'état Sb en émettant de la chaleur,
de l'état Sb à l'état F en :
1 - émettant de la lumière (fluorescence),
2 - transférant son énergie à une molécule très proche (résonnance),
3 - en perdant un électron (photochimie).

Remarques :
1 - la fluorescence concerne soit des molécules de chlorophylle qui ne sont pas parfaitement organisées dans la membrane au sein des photosystèmes, soit des molécules qui ne peuvent pas transmettre leur énergie à une molécule voisine en solution ou du fait d'un encombrement dans les réactions en aval dans le transport des électrons.
2 - le transfert d'énergie peut se faire jusqu'à une molécule de chlorophylle spécialisée qui se désactive alors par photochimie, soit à d'autres pigments (caroténoïdes) qui se désactivent alors en émettant de la chaleur (dissipation thermique en cas d'excès de lumière).

Schéma simplifié de l'exitation (états Sa et Sb) et du retour à l'état fondamental (F) d’une molécule de chlorophylle par fluorescence, résonnance ou photochimie.

7 - Spectres d'absorption et spectre d'action

Comment obtenir un spectre d'action?
Timiriazef a fait pousser des plantes en les éclairant au moyen d'un large spectre, chaque plante étant éclairée par une longueur d'onde donnée. Il a ainsi montré que la photosynthèse était maximum pour les lumières bleues et rouges. Cependant cette expérience est sujette à critiques car on ne connaît pas l'intensité exacte de chaque radiation. Timiriazef ne tenait pas compte non plus de l'énergie de chaque photon.
Engelman a réalisé la même expérience en utilisant une méthode biologique pour la détermination de la photosynthèse. Il utilise le tactisme positif que présente une bactérie (Bactérium thermo) pour l'oxygène. Il observe une algue verte filamenteuse au microscope en l'éclairant par un micro spectre. Les bactéries se rassemblent contre l'algue aux endroits éclairés par les radiations rouges et bleues. Il en déduit que ce sont ces radiations qui sont les plus efficaces pour la production d'oxygène lors de la photosynthèse.

Expérience d'Engelman

Aujourd'hui on peut réaliser de véritables spectres d'action en utilisant des illuminateurs spectraux et en règlant les radiations à énergie constante.

Comparaison d'un spectre d'absorption et d'un spectre d'action. Absorption (courbe rouge) en % de l’absorption totale de la lumière incidente par des chlorelles. Action (courbe bleue) : activité photosynthétique en unité arbitraire.

Dans ces conditions, les deux spectres se superposent dans le bleu (vers 450 nm), s'écartent largement l'un de l'autre vers 460 nm (absorption des carotènes), vers 640 nm (absorption des chlorophylles) et chutent brutalement au delà de 680 nm.
Le dégagement de O₂ est nul à 720 nm (il y a une "chute dans le rouge" de l'intensité photosynthétique).

03 - Comment établir l'équation globale de la photosynthèse?

SOMMAIRE

05 - Comment mesurer la photosynthèse?