Accueil
Bioch
B.Cell
B.Dev
B.Mol
B.V.
Gen
Phy.V.
T.P
Zoo
Web
[Sommaire]
 

MICROSCOPIE à FLUORESCENCE

 

Comment obtenir des images bi- ou tricolores ?

Le principe du microscope à fluorescence "classique" nécessite des filtres d'excitation et d'émission. Par définition, la lumière sélectionnée par les filtres d'excitation correspond au spectre d'absorption du fluorochrome utilisé et la lumière recueillie au niveau de l'oculaire (pour l'oeil ou pour le système d'analyse de l'image) ne correspond qu'aux radiations émises spécifiquement par le fluorochrome choisi. Si dans une préparation, on utilise plusieurs fluorochromes, il paraît donc difficile d'observer en même temps les radiations émises par chacun d'eux. Plusieurs solutions ont été envisagées.

On prendra comme exemple une préparation de cellules de Kangourou (PTK) en culture. Elles ont été traitées par un anticorps anti-kinétochore marqué avec un dérivé de la rhodamine (TRITC,Tetra methyl Rhodamine Iso Thio Cyanate), par un autre anticorps anti-tubuline marqué avec un dérivé de la fluorescéine (FITC, Fluoresceine Iso Thio Cyanate) et par le DAPI (Di Aminido Phenyl lndol), réactif spécifique de l'ADN.

1-L'excitation du fluorochrome puis la réception de l'image de fluorescence se réalise de manière indépendante et on obtient trois images distinctes en photographie analogique (pellicule photographique classique).

Jeu de filtres pour fluorescence rouge
Jeu de filtres pour fluorescence verte
Jeu de filtres pour fluorescence bleue
Fluorescence rouge des kinétochores aux pôles du fuseau.
Fluorescence verte des microtubules du fuseau.
Fluorescence bleue de l'ADN dans les noyaux en interphase et des chromosomes de l'anaphase.

2-En image analogique, il est possible de superposer sur la même pellicule les trois images successives. On obtient à la fin une image tricolore mais il est impossible de séparer les couleurs et de retrouver les images correspondant à chacun des fluorochromes.

R
R+V
R+V+B
Image unicolore.
Image bicolore.
Image tricolore.

3-En images numériques, tout s'arrange! On obtient les trois images séparément avec les trois jeux de filtres, puis à l'aide d'un logiciel de traitement d'images, on peut superposer les différentes observations tout en gardant les images de base...

R
V
B
R+V
V+B
B+R
...et obtenir au final une image tricolore complète R+V+B.

Ces images sont rassemblées sur une animation interactive "flash" (44 Ko)

4-Actuellement les systèmes informatiques associés au microscope sont capables par un jeu de balayage de mélanger de manière quasi instantanée les différentes images et d'obtenir ainsi des images à plusieurs composantes simultanément.

Caroline Benlot, Nicole Blanchouin, Michel Delarue, Michèle Mosiniak, Roger Prat et Véronique Vonarx
Collaboration : Philippe Guillaud
© Copyright "Biologie et Multimédia"

Mise en ligne : septembre 1999
Dernière modification : juillet 2002