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MICROSCOPIE à FLUORESCENCE

Utilisation d'un fluorochrome à fluorescence bleue

Les colorants fluorescents en bleu sont nombreux. L'exemple choisi est celui du DAPI (Di Aminido Phenyl lndol) colorant utilisé en cytochimie et spécifique de l'ADN.

Le DAPI (Di Aminido Phenyl lndol) se fixe spécifiquement sur l'ADN. Eclairé en lumière violette (max 372nm), il emet une fluorescence bleue (max 456nm).

Un fluorochrome est caractérisé par deux spectres : son spectre d'absorption (de la lumière incidente) et son spectre d'émission de fluorescence.

Comme on le voit, le DAPI absorbe les radiations violettes (max 372nm) et restitue une fluorescence bleue (max 456nm).

 

Le microscope doit être équipé d'un jeu de filtres correspondant aux caractéristiques du fluorochrome :

  • 1-un filtre d'excitation permettant la sélection des radiation absorbées par le fluorochrome (environ 380nm),
  • 2-un miroir dichroïque réfléchissant les radiations absorbables vers l'échantillon et ne laissant passer par transmission que les radiations bleues et au dessus (ici >400nm),
  • 3-un filtre d'émission ne laissant passer par transmission que les radiations bleues et au dessus (>400nm).

Optique simplifiée du microscope à fluorescence :

  • 1-lampe à arc
  • 2-filtre d'excitation
  • 3-miroir dichroïque
  • 4-objectif
  • 5-préparation
  • 6-filtre d'émission
  • 7-oculaire

Le trajet des radiations lumineuses est complexe.

Le filtre d'excitation sélectionne les radiations spécifiques du fluorochrome... ...qui sont réfléchies par le miroir et éclairent l'échantillon... ...celui-ci émet les radiations de fluorescence qui seules atteignent l'oculaire.

Voici en vue moins schématique les résultats d'une expérience :

le DAPI est utilisé pour localiser l'ADN dans des cellules en culture (cellules PTK).

Observation témoin classique en lumière blanche. Observation en utilisant le jeu de filtres spécifique de la rhodamine. Observation en utilisant le jeu de fitres spécifique de la fluorescéine.

L'ADN est, comme on s'en doutait, localisé essentiellement dans les noyaux (chromatine). Ces cellules sont en interphase. Au cours de la mitose, on observerait que l'ADN est essentiellement localisé dans les chromosomes.

Caroline Benlot, Nicole Blanchouin, Michel Delarue, Michèle Mosiniak, Roger Prat et Véronique Vonarx
Collaboration : Philippe Guillaud

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Mise en ligne : septembre 1999
Dernière modification : juillet 2002