Un microscope à fluorescence est un microscope photonique équipé
de deux lampes, une lampe ordinaire pour une observation classique par transmission
et une lampe à arc pour la fluorescence. Des filtres d'excitation permettent
de choisir la longueur d'onde incidente et des filtres d'émission (ou
d'arrêt) permettent de sélectionner les radiations émises
par l'objet excité.
Un microscope équipé en épifluorescence est pourvu de
plusieurs jeux de filtres correspondant aux fluorochromes les plus habituellement
utilisés. Chaque jeu de filtres est constitué d'un filtre d'excitation,
d'un miroir dichroïque et d'un filtre d'émission. Les fluorochromes
les plus classiques sont la rhodamine et ses dérivés, la fluorescéine
et ses dérivés et le DAPI. Ils émettent respectivement
dans le rouge, le vert et le bleu.
La fluorescence observée peut avoir plusieurs
origines :
Fluorescence naturelle d'une substance située dans la cellule, exemple
: la chlorophylle fluoresce naturellement en rouge.
Utilisation d'une substance fluorescente se fixant spécifiquement
sur une structure. Il s'agit là d'un test de type cytochimique, exemple
: le DAPI se fixe spécifiquement sur l'ADN et fluoresce en bleu.
Utilisation d'une substance non spécifique fluorescente naturellement,
exemple : rhodamine et fluoresceine. Cette substance est fixée sur
un anticorps spécifique d'un antigène. La spécificité
est due à l'anticorps. La fluorescence observée permet de localiser
l'antigène.
Traceurs de lignage cellulaire en biologie du développement : la
rhodamine, la fluorescéine, le Texas red ou autre est fixé sur
une molécule de dextran. Le tout est microinjecté dans une cellule
et les cellules filles seront marquées au cours du développement
embryonnaire.
Intégration d'une séquence codant pour une protéine
naturellement fluorescente dans le "gène" codant pour une
protéine. La protéine recherchée devient naturellement
fluorescente et les observations peuvent se réaliser "in vivo".
Trois exemples d'utilisation de la fluorescence
: choix du fluorochrome, caractéristiques
optiques du fluorochrome, spectres des filtres et résultats d'une expérience.
Protocole 1 : utilisation du TRITC
(Tetramethyl Rhodamine Iso Thio Cyanate,
dérivé de la Rhodamine) : fluorescence rouge
Protocole 2 : utilisation du FITC (Fluoresceine Iso Thio
Cyanate, dérivé de la fluoresceine) : fluorescence verte
Protocole 3 : utilisation du DAPI
(Di Aminido Phenyl lndo, réactif spécifique
de l'ADN) : fluorescence bleue
Comment obtenir des images complexes comportant plusieurs
fluorescences de longueurs d'onde différentes?
