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Transgenèse bactérienne


  • Introduction
La transgenèse est une technique de biologie moléculaire destinée à transformer le génome d’un organisme receveur en y insérant un gène (transgène) qu’il ne possède pas naturellement. Elle est devenue aujourd’hui une pratique courante de laboratoire car ses applications pratiques sont nombreuses et variées. Outre la production controversée d'organismes génétiquement modifiés (OGM) dans un but commercial, elle permet le clonage des gènes, leur expression dans un organisme, l'obtention des protéines correspondantes ou l'insertion d'un gène muté dans un organisme pour en examiner les conséquences. Aussi, pratiquement tous les domaines de la recherche en biologie font désormais appel à cette technique.
Historiquement, c’est en 1971 qu’un microorganisme comportant un gène étranger fut fabriqué pour la première fois lorsque Paul Berg parvint à introduire un fragment d'ADN du virus SV40 dans la bactérie Escherichia coli ouvrant la voie à ce qu’il est convenu d’appeler aujourd’hui techniques de l’ADN recombinant, génie génétique ou ingénierie génétique. 
Les techniques de transgenèse ont pour origine les travaux d’un microbiologiste anglais, Fred Griffith, qui cherchait à mettre au point un vaccin contre la pneumonie à pneumocoque. En 1932, il montra que les bactéries responsables de cette maladie pouvaient transmettre certains de leurs caractères, notamment leur virulence, à des souches de pneumocoques non virulents. Alors même qu’ils avaient été tués par la chaleur, des pneumocoques pouvaient transmettre leur virulence et l'acquisition de cette caractéristique par la souche non virulente devenait héréditaire. Cette découverte était tellement incroyable à l’époque que Griffith hésita pendant quatre ans avant de publier ses résultats. Seul le transfert d'une substance chimique entre des bactéries mortes et des bactéries vivantes pouvait expliquer cette transformation et Oswald Avery réussit en 1944 à isoler la substance transformante qui se révéla être de l’acide désoxyribonucléique (ADN) suscitant une foule de travaux de recherche qui aboutirent notamment à l’élucidation de la structure de la molécule d’ADN et aux techniques actuelles de transgenèse.

Les bactéries se prêtent particulièrement aux expériences de transgenèse car il est techniquement facile de leur faire intégrer des plasmides, petites molécules d’ADN circulaire que de nombreuses bactéries contiennent naturellement. 
L’Association des Professeurs de Biologie-Géologie (APBG) commercialise un kit conçu par l’École de l’ADN de Nîmes permettant l’étude pratique d’une transgenèse bactérienne. Le kit permet d'introduire dans une souche du colibacille Escherichia coli naturellement sensible à l'antibiotique ampicilline un plasmide (pUC18) comportant un gène de résistance à cet antibiotique. Les bactéries transformées par le plasmide deviennent alors résistantes à l'ampicilline et deviennent donc aptes à se multiplier sur un milieu contenant cet antibiotique ce qui permet de les différencier des bactéries non transformées qui ne peuvent se multiplier sur un tel milieu.
C’est la mise en œuvre de ce kit qui est présentée ci-dessous.
 

Outre l'ensemble des produits contenus dans le kit, les manipulations nécessitent du matériel courant de laboratoire (bain marie, centrifugeuse, tubes Eppendorf, boîtes de Pétri, bec bunsen, micropipettes automatiques ou pipettes Pasteur) et doivent être menées en conditions stériles. 

Après les manipulations, toutes les cultures doivent être détruites par un traitement à l'eau de javel ou à l'autoclave pour éviter la dispersion des bactéries dans l'environnement.

Dès la réception du kit, les produits doivent être stockés différemment selon leur nature : les poudres destinées à la préparation des milieux de culture sont stockées à température ambiante ; les cultures bactériennes sur boîte de Pétri sont conservées au réfrigérateur ; l'ampicilline et la solution de plasmide pUC 18 sont placées au congélateur. 

 


Matériel nécessaire
  • Préparation du matériel et des milieux 
Le matériel nécessaire doit être stérilisé et les milieux stériles préparés préalablement aux manipulations proprement dites.
    • Préparation des milieux
      Deux milieux différents doivent être préparés : un milieu liquide ou bouillon (LB : Luria broth) permettant la multiplication des bactéries receveuses et un milieu solide (LA : Luria broth agar), similaire au précédent mais contenant de l'agar pour le rendre solide.Une partie de ce dernier est utilisée pour réaliser un milieu contenant de l'ampicilline destinée à sélectionner les bactéries transformées.
      Les deux milieux sont reconstitués à partir des boîtes de poudre fournies en dissolvant respectivement 25 g de poudre LB dans un litre d'eau distillée et 32 g de poudre LA dans un litre d'eau distillée. Ils sont ensuite stérilisés. 
      L'addition de l'ampicilline au milieu LA à raison de 100 µg.mL-1 doit être faite après la stérilisation, au moment de couler le milieu dans les boîtes de Pétri car l'ampicilline est thermolabile. 
      La solution de chlorure de calcium fournie doit être diluée au 1/10 avec de l'eau distillée avant stérilisation et répartie dans des tubes Eppendorf à raison de 0,5 mL par tube (50 mmol.L-1).
       
    • Stérilisation du matériel
      Il est possible de se procurer les petits matériels (pipettes Pasteur, boîtes de Pétri, cônes de pipette, tubes Eppendorf) déjà stérilisés et conservés dans un emballage stérile. Dans ce cas, n'ouvrir les emballages que dans la zone stérile à proximité du bec Bunsen.
      Les milieux LB et LA ainsi que le petit matériel  (pipettes Pasteur, boîtes de Pétri, cônes de pipette, tubes Eppendorf, solution de chlorure de calcium, eau distillée) peuvent être stérilisés à l'autoclave ou, à défaut, à la cocotte minute. Dans ce cas, mettre un peu d'eau au fond de la cocotte (sur 2 cm de hauteur) et placer dans le panier destiné à la cuisson à la vapeur le petit matériel enveloppé dans du papier d'aluminium et les flacons. Attendre 20 minutes après la mise en rotation de la soupape.
      Les flacons et les paquets de papier d'aluminium contenant le petit matériel sont ensuite disposés à proximité du bec Bunsen et doivent être ouverts dans la zone stérile autour de la flamme.
       
    • Répartition des solutions
      Attendre le refroidissement des solutions jusqu'à ce que les flacons puissent être manipulés sans se brûler avant de les répartir dans les récipients appropriés :
      1. Le milieu LB stérile est réparti dans des tubes Eppendorf stériles à raison de 1 mL par tube.
      2. Du milieu LA sans ampicilline est coulé dans des boîtes de Pétri stériles (6 mL de milieu pour une boîte de 6 cm de diamètre).
      3. Du milieu LA est d'abord additionné d'ampicilline à raison de 1 mL d'ampicilline pour 200 mL de milieu avant d'être coulé dans des boîtes de Pétri stériles (6 mL pour une boîte de 6 cm de diamètre ).
      4. La solution de chlorure de calcium à 50 mmol.L-1 est répartie dans des tubes Eppendorf stériles à raison de 0,5 mL par tube. 
      5. La solution de plasmide pUC 18 est répartie dans des tubes Eppendorf stériles à raison de 15 µL par tube. 

      6.  
    • Culture des bactérie receveuses
      Les bactéries receveuses sont fournies sous forme de colonies sur boîtes de milieu solide :

Colonies de colibacille sur boîte de Pétri
      Elles doivent être mises en culture dans le bouillon LB avant d'entreprendre leur transformation.
      Pour cela, prélever stérilement quelques colonies avec un ensemenceur ou un cure-dents stérile et les placer dans un tube stérile de bouillon LB. 
      Agiter le tube sur vortex et incuber 24 h à 37°C (48 h à température ambiante). La multiplication des bactéries se traduit par l'apparition d'un trouble dans le milieu comme on peut le voir sur le cliché ci-dessous. 
       

Culture de colibacilles en milieu liquide

La suspension de bactéries est ensuite répartie dans des tubes Eppendorf stériles à raison de 1 mL de suspension par tube.
 

  • Protocole de transformation

  •  
    • Pour réaliser la transformation proprement dite, réunir :
      1. 2 tubes contenant 1 mL de culture bactérienne. Marquer les tubes par "pUC+" et "pUC-" respectivement.
      2. 1 tube contenant de l'eau distillée stérile
      3. 1 tube contenant 0,5 mL de la solution de chlorure de calcium
      4. 1 tube contenant 15 µL de la solution de plasmide pUC 18 (2,5 ng.µL-1)
      5. 2 boîtes de Pétri avec milieu solide LA sans ampicilline
      6. 2 boîtes de Pétri avec milieu solide LA additionné d'ampicilline (100 µg.mL-1)
      7. Bac de glace pilée
      8. Bain marie à 42°C
      9. 1 râteau réalisé en pliant à la flamme l'extrémité d'une pipette Pasteur boutonnée comme on peut le voir sur le cliché ci-dessous. Bien que la notice du kit préconise d'utiliser des billes de verre (fournies) pour étaler les bactéries, le rateau s'avère plus efficace pour cet usage.

      10.  

Râteau pour l'étalement des bactéries
    • Procédure

    •  
Objectif des opérations réalisées
1. Centrifuger les deux tubes pUC+ et pUC- à 3 500 tours/minute pendant 3 minutes et éliminer le surnageant. Récupération des bactéries en suspension.
2. Ajouter 200 µL de solution de chlorure de calcium et 10 µL de la solution de plasmide au tube pUC+.
3. Ajouter 200 µL de solution de chlorure de calcium et 10 µL d'eau stérile au tube pUC-.
Le calcium fragilise les enveloppes bactériennes facilitant ainsi la  pénétration du plasmide.

Témoin négatif.

4. Remettre en suspension les deux culots en agitant sur vortex et placer les deux tubes dans la glace pendant 10 minutes.
5. Placer les deux tubes au bain marie à 42°C pendant 90 secondes.
6. Remettre les deux tubes dans la glace pendant 10 minutes.

Choc thermique.
7. Ajouter 400 µL de bouillon LB dans chacun des tubes. Milieu nutritif pour faire pousser les bactéries.
8. Déposer 100 µL (ou 3 gouttes) du tube pUC+ au centre d'une boîte avec ampicilline et 100 µL au centre d'une boîte sans ampicilline. Permet de mesurer l'efficacité de la transformation en comparant le nombre de colonies dans les deux boîtes.
9. Déposer 100 µL du tube pUC- au centre d'une boîte avec ampicilline et 100 µL au centre d'une boîte sans ampicilline. Témoins non transformés.
10. Utiliser le râteau (passé à la flamme puis refroidi) pour étaler les bactéries à la surface du milieu dans chaque boîte. Veiller à bien stériliser le râteau entre deux étalements. Répartition des bactéries sur toute la surface du milieu.
11. Incuber les boîtes à 37°C pendant 24 à 48 h en les plaçant couvercle vers le bas. Croissance des bactéries. Le retournement des boîtes empêche l'eau de condensation de se déposer sur les cultures.
 
  • Résultats

  • Dans les boîtes contenant de l'ampicilline, seules les bactéries ayant intégré le plasmide portant le gène de résistance à l'ampicilline sont capables de pousser. Comme un petit nombre seulement de cellules sont transformées, on observe un petit nombre de colonies seulement. 
    Dans les boîtes ne contenant pas d'ampicilline, toutes les bactéries poussent. Comme elles sont très nombreuses, les colonies deviennent confluentes et forment un tapis continu ("gazon") à la surface du milieu. 

Cliquer sur l'image pour l'agrandir
Quelques colonies de bactéries résistantes
(donc transformées : milieu avec ampicilline)
Cliquer sur l'image pour l'agrandir
Tapis de bactéries transformées ou non
(milieu sans ampicilline)

    
École de l’ADN
Muséum de Nîmes
19, Grand-rue BP 81295
30015 Nîmes Cedex 1
Téléphone : 04 66 67 82 29

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