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Modèles moléculaires

Spectres d'absorption de l'hémoglobine

  • Principe

  • On mesure l'absorption de la lumière d'une solution d'hémoglobine dans le visible avec un spectrophotomètre. Selon l'état de la molécule d'hémoglobine, ses caractéristiques d'absorption de la lumière sont modifiées conduisant à des spectres d'absorption différents. L'identification des principaux maxima d'absorption (pics) permet ainsi de distinguer les différents états de l'hémoglobine.
  • Préparation de la solution d'hémoglobine à partir de globules rouges

  • On utilise du sang ou des globules rouges d'animaux (sang de mouton ou sang de cheval disponibles dans le commerce).
    • Laisser décanter ou centrifuger 5 mL de sang et éliminer le surnageant avec une pipette Pasteur munie d'une tétine.
    • Ajouter au culot 10 mL d'eau distillée et laisser décanter les débris membranaires ou centrifuger.
    • Récupérer le surnageant qui constitue la solution stock d'hémoglobine.
    • On utilisera une solution plus ou moins diluée en fonction de la couleur de la solution stock (environ au 1/300). Vérifier au spectrophotomètre que l'absorption maximale reste dans la gamme de mesure de l'appareil. Si le pic principal est écrêté, diluer davantage.
  • Obtention des différents états de l'hémoglobine et des spectres correspondants

  • Tenir prêts 10 mL de solution d'hémoglobine diluée comme indiqué précédemment.
       
    • Oxyhémoglobine : faire buller pendant quelques minutes de l'air avec une pompe d'aquarium reliée à un cathéter dans un tube contenant la solution d'hémoglobine diluée. Si la solution doit être diluée de nouveau, faire buller de nouveau de l'air.
    • Hémoglobine : Ajouter une goutte de réactif de Stokes pour évacuer l'oxygène et régénérer l'hémoglobine ou préparer une solution de dithionite de sodium ["hydrosulfite"de sodium] à 50 mg/10 mL et déposer une goutte de cette solution dans la cuve contenant l'oxyhémoglobine. L'avantage du réactif de Stokes est la réversibilité.
    • Méthémoglobine : reprendre 2 mL de la solution diluée d'hémoglobine. Préparer une solution de ferricyanure de potassium à 10 mg/10 mL. Déposer une goutte de cette solution dans la cuve contenant l'hémoglobine.
    • Carboxyhémoglobine : reprendre 2 mL de la solution diluée d'hémoglobine. Allumer une cigarette et en souffler la fumée à travers la solution par un cathéter : le CO contenu dans la fumée de cigarette détermine la formation de carboxyhémoglobine très stable.
    • Carbaminohémoglobine :  faire passer un courant de dioxyde de carbone dans la solution d'hémoglobine par un cathéter. Si on ne dispose pas d'une bouteille de dioxyde de carbone, adapter le cathéter sur un bouchon pour erlenmeyer. Déposer dans l'erlenmeyer quelques grammes de carbonate de calcium. Verser dessus 10 mL d'acide chlorhydrique et adapter immédiatement le bouchon de façon à ce que le cathéter amène le dégagement de dioxyde de carbone dans la solution.
  • Mesures
    • Verser 2 mL de chaque solution dans une cuvette standard (trajet optique de 10 mm)  et mesurer l'absorption pour l'ensemble du spectre visible avec une résolution d'au moins 10 nm entre chaque point de mesure. Si l'appareil le permet, augmenter la résolution dans les régions des pics présumés d'absorption.
    • Certains spectrophotomètres effectuent un balayage automatique du spectre.
  • Matériel
    • Tout spectrophotomètre muni d'une sortie analogique peut être relié à une interface d'acquisition de données et piloté par un logiciel généraliste.
    • Les appareils munis d'une interface série se connectent sur le port série (RS 232) de l'ordinateur et sont pilotés par leur propre logiciel.
    • Les enregistrements présentés à la page des résultats ont été obtenus avec un spectrophotomètre SECOMAM S 250 PC muni d'une liaison RS 232 avec l'ordinateur et piloté par le logiciel du fabriquant (voir photo). Le balayage de l'ensemble du spectre est automatique de 380 nm à 660 nm.
     

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    Matériel de mesure :
    Spectrophotomètre piloté par ordinateur


    Accéder aux résultats


  • Réactif de Stokes (ferrotartrate d'ammonium, pour un litre)
    Sulfate ferreux…………………….20 g
    Acide tartrique……………………30 g
    Juste avant usage, ajouter de l'ammoniaque jusqu'à redissolution du précipité.

    Le réactif de Stokes permet d'éliminer totalement l'oxygène de l'oxyhémoglobine pour restaurer l'hémoglobine.



Bio-Rad Laboratories, S.A. 
3 boulevard Raymond Poincare 
92430 Marnes La Coquette 
France 
Phone: 33 1 47 95 60 00 
Fax: 33 1 47 41 91 33 

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