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Détermination par spectrophotométrie de la 
concentration en microorganismes dans une culture

On a souvent besoin lors d'expériences sur les microorganismes, bactéries, levures, algues unicellulaires, etc. de déterminer le nombre de cellules présentes dans une culture. Diverses méthodes peuvent être utilisées comme la numération directe, les dilutions en série suivies d'étalement sur milieu solide, la spectrophotométrie. Ces méthodes peuvent s'appliquer tant aux microorganismes procaryotes, comme les bactéries, qu'aux microorganismes eucaryotes, comme les levures ou les algues unicellulaires. La méthode spectrophotométrique est relativement simple à mettre en oeuvre et présente divers avantages pédagogiques : utilisation d'un instrument de laboratoire très commun, interfaçage éventuel avec un ordinateur, construction et exploitation d'une droite d'étalonnage. Nous prendrons ici l'exemple des levures dont la culture est particulièrement facile et peut être menée dans les établissements scolaires pour résoudre divers problèmes biologiques.

  • Principe
Lorsque des cellules sont en suspension dans un milieu liquide traversé par un faisceau lumineux monochromatique, la quantité de lumière absorbée par la suspension est proportionnelle à la concentration des cellules. La relation entre absorbance et concentration en cellules est linéaire dans une gamme de concentrations couvrant environ un ordre de grandeur. En partant d'une suspension de concentration connue, une gamme de dilution est réalisée et l'absorbance de chaque suspension est mesurée avec un spectrophotomètre. La droite Absorbance = f (concentration en cellules) est alors construite. Pour déterminer la concentration en cellules d'une suspension, on utilise une méthode graphique : on mesure l'absorbance d'un échantillon, après dilution si nécessaire, et on reporte la valeur obtenue sur la droite d'étalonnage pour en déduire sa concentration. La concentration en cellules de la suspension servant à construire la droite d'étalonnage aura été déterminée au préalable avec une lame à numération (cellule de Malassez ou lame à numération jetable).
 
 
Protocole
  • Construction de la droite d'étalonnage
    • Préparer une suspension de levure de boulanger (levure fraîche) à 0,1 g/100 mL.
    • Prélever un échantillon de la suspension avec une pipette Pasteur et remplir la chambre de comptage d'une lame à numération.

Lame à numération KOVA
    • Au grossissement moyen du microscope, faire la mise au point sur la grille et compter le nombre de cellules présentes dans un carré. Si ce nombre est trop élevé, faire une dilution, par exemple au 1/10 et refaire une numération.
    • Déterminer le nombre de cellules par unité de volume en suivant les spécifications données par le fabricant (lame Kova : multiplier le nombre de cellules par carré élémentaire par 90 pour obtenir le nombre de cellules par µL).
    • Régler le spectrophotomètre sur une longueur d'onde rouge (630 nm par exemple) et déterminer le zéro d'absorbance avec une cuve remplie d'eau.
    • Réaliser une série de dilutions de la suspension initiale (1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16). Il est plus simple de faire les dilutions directement dans des cuves standards de spectrophotomètre en suivant par exemple le tableau suivant qui s'applique à une suspension de levures de boulangerie à 1g/L (0,1 g/100 mL). Utiliser de l'eau physiologique (NaCl à 9 g/L) comme liquide de dilution.
Volume de la suspension mère
(mL)
Volume d'eau physiologique
(mL)
3
0
1,5
1,5
0,75
2,25
 0,375
2,625 
0,187 
2,812 
    • Mesurer l'absorbance de chaque cuvette.
    • Construire le graphique Absorbance = f [cellules].
    • Conserver uniquement les points alignés le long d'une droite.

    •  

Droite d'étalonnage : Absorbance = f [cellules]
Cliquer sur la figure pour l'agrandir
  • Détermination de la concentration en cellules dans une culture
    • Prélever un échantillon de la culture.
    • En fonction de son aspect, faire éventuellement une dilution (comparer avec les cuvettes ayant servi à construire la droite d'étalonnage).
    • Mesurer l'absorbance de l'échantillon.
    • Reporter l'absorbance mesurée sur la droite et lire la concentration sur l'axe des abscisses.
    • Corriger de la dilution éventuelle du prélèvement.
Détermination graphique de la concentration
Valeur lue : 2 429 cellules par microlitre
Cliquer sur la figure pour l'agrandir


  • Lames de numération KOVA-SLIDE
    • SORDALAB

    • Z.A. Les Poupettes 91580 Villeneuve sur Auvers
      Téléphone : 01 69 92 26 72  
      Télécopie : 01 69 92 26 74
      sordalab@wanadoo.fr
  • Levures
    • SORDALAB (distribue aussi divers kits de TP)

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