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Test ELISA : détection d'anticorps de lapin anti-BSA


  •  Introduction
Le test ELISA (acronyme de Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est un test immunologique destiné à détecter et/ou doser une protéine dans un liquide biologique. Son principe est indiqué à la page Test ELISA : détection de la bêta-lactoglobuline bovine.
Dans le test présenté ici, on recherche dans un sérum de lapin un anticorps dirigé contre la sérum-albumine bovine (BSA). Les puits d’une microplaque ont été tapissés à l'avance avec de la BSA qui se fixe au plastique des puits par interactions électrostatiques. La BSA permet la capture spécifique des anticorps anti-BSA éventuellement présents dans les sérums testés. Les anticorps anti-BSA sont ensuite révélés par un anticorps traceur anti-immunoglobuline de lapin conjugué à la peroxydase. La réaction de l'enzyme avec la tétraméthylbenzidine donne un dérivé bleu dont la concentration est proportionnelle à celle des anticorps détectés. 

Barrettes de microtitration dans leur support
  • Protocole
 
Le kit fourni par la société Sordalab comporte les barrettes de puits recouverts par la BSA et leur support ainsi que l'ensemble des réactifs nécessaires, soit prêts à l'emploi (tampon PBS-tween), soit à reconstituer avec de l'eau distillée ou du tampon phosphate salé (Phosphate Buffer Saline, PBS) à partir de solutions concentrées ou de produits lyophylisés selon les instructions données dans le mode d'emploi.

Si on désire faire un dosage de l'anticorps dans un sérum inconnu, il convient de réaliser au préalable une gamme de dilution de la solution d'anticorps initiale de façon à construire une courbe d'étalonnage. La solution mère d'anticorps, obtenue en diluant les anticorps fournis dans 15 mL de PBS, comporte 17 µg d'anticorps de lapin anti-BSA par mL. On l'appellera C1.
 

La gamme est réalisée par des dilutions en série au 1/2 selon les indications du tableau ci-dessous :
Volume d'anticorps à prélever (mL)
Volume de PBS à ajouter (mL)
Nom
Concentration
(µg.L-1)
7,5 de C1
7,5
C2
8,50
7,5 de C2
7,5
C3
4,25
7,5 de C3
7,5
C4
2,12
7,5 de C4
7,5
C5
1,06
7,5 de C5
7,5
C6
0,53
7,5 de C6
7,5
C7
0,26
7,5 de C7
7,5
C8
0,13
Gamme de dilutions
Dans tous les cas, la procédure est similaire :
  1. Déposer 80 µL de sérum à tester ou 80 µL des différentes dilutions d’anticorps dans les puits et incuber 15 min à température ambiante. 
  2. Vider les puits par retournement et rincer deux fois en remplissant les puits avec le tampon PBS-tween et en les vidant par retournement.
  3. Déposer 80 µL de la solution d’anticorps de détection dans les puits.
  4. Incuber 15 min à température ambiante.
  5. Vider les puits par retournement et rincer deux fois avec le tampon PBS-tween.
  6. Déposer 80 µL de la solution de révélation (tétraméthylbenzidine, TMB) et incuber 5 min à température ambiante.

Gamme de dilution de l'anticorps de lapin anti-BSA
(avant et après addition de la TMB)
La présence d'anticorps anti-BSA se traduit par l'apparition d'une coloration bleue d'autant plus importante que la concentration en anticorps est élevée.
NB Si on ne dispose pas de micropipette automatique, utiliser des pipettes Pasteur comme compte gouttes pour déposer les réactifs. Deux gouttes de pipette Pasteur sont équivalentes à 80 µL.
  • Résultats
La quantification des résultats de tests ELISA est réalisée habituellement avec un lecteur de microplaques. Si on ne dispose pas d'un tel matériel, ce qui est le cas le plus souvent dans les laboratoires des lycées, la quantification reste possible. Soit avec un colorimètre après avoir versé le contenu des puits à analyser dans des microcuves de spectrophotomètre, soit en mettant à profit les possibilités de l'informatique : en effet, l'intensité de la coloration obtenue dans les différents puits peut être évaluée sur une image numérique des résultats avec un logiciel approprié comme ceux présentés sur ce site à la page concernant les applications de l'électrophorèse en immunologie
On peut se procurer ce type de logiciel sur Internet aux adresses suivantes :
Pour se procurer Digispec : le demander par un courrier électronique à l'auteur
Pour se procurer Mesurim : se connecter par Internet sur le site SVT de l'Académie d'Amiens où le logiciel est téléchargeable.
Si l'on désire simplement observer le résultat d'un test qualitatif, on peut utiliser la solution mère d'anticorps comme témoin positif ainsi que divers témoins négatifs (sérum normal de lapin, puits sans anticorps traceur, puits sans TMB...).
En ajoutant 80 µL d'acide chlorhydrique à 1 mol.L-1 dans chaque puits, la réaction enzymatique est stoppée et la coloration vire au jaune ce qui permet, le cas échéant, de quantifier la réaction par colorimétrie à 450 nm.
 

Quelques résultats après traitement par HCl
Pour déterminer précisément la concentration en anticorps anti-BSA dans un sérum inconnu, il est nécessaire de construire une courbe d'étalonnage à partir des résultats obtenus avec la gamme de dilution de la solution mère d'anticorps présentée ci-dessus
Pour cela, une image numérique des résultats au format .bmp est d'abord obtenue avec un scanner ou un appareil photo et le profil densitométrique est calculé avec le logiciel de traitement Digispec ou Mesurim. Les données sont ensuite traduites graphiquement avec un logiciel tableur-grapheur quelconque.
Les résultats sont présentés dans le montage ci-contre.

Superposition des résultats de la gamme étalon
et du profil densitométrique correspondant

Profil densitométrique d'une 
barrette traitée par HCl
Le même type de traitement peut aussi être réalisé après traitement des puits par HCl comme le montre le montage ci-contre.
Les différents paliers du profil sont ensuite quantifiés en utilisant les fonctions du tableur ou d'un logiciel graphique.
La courbe étalon, représentant la densité de coloration des puits en fonction de la concentration en anticorps, est alors tracée. Pour la gamme de dilutions utilisées, la relation entre densité de coloration et concentration en anticorps est linéaire comme le montre la figure ci-dessous correspondant aux résultats obtenus pour la gamme C1-C8 sans traitement final par HCl.
Dès lors, la détermination de la concentration en anticorps dans d'autres puits peut être déterminée graphiquement : après avoir mesuré de la même façon sur une image numérique la densité de coloration des puits contenant une concentration inconnue en anticorps, la densité mesurée est reportée sur la droite. La concentration recherchée correspond à l'abscisse de ces points .

Courbe d'étalonnage
(les étiquettes des points correspondent à la densité relative de la couleur dans les puits)


  • Kit comportant l'ensemble des produits nécessaires  :
    SORDALAB
    ZA DES POUPETTES 
    91580 VILLENEUVE SUR AUVERS 
    Téléphone : 0169922672

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