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Double diffusion en gel (Ouchterlony)
  • Principe
La méthode de double diffusion en gel d’Ouchterlony est une méthode d'immunoprécipitation fondée sur la diffusion d’antigènes et d’anticorps en milieu solide (en général un gel d’agarose) à partir de puits placés en vis à vis. Lorsque les molécules d'anticorps rencontrent les molécules d'antigènes, la liaison antigène-anticorps conduit à la précipitation des complexes immuns dans la zone de rencontre si l’anticorps reconnaît l’antigène. Le précipité se forme dans la zone où les concentrations des deux solutions sont optimales pour que la quantité d’anticorps sature les sites antigéniques, c'est à dire la zone d’équivalence. Les précipités se présentent sous la forme d’un arc blanchâtre visible à l’œil nu. 
La méthode d’Ouchterlony peut être utilisée notamment pour détecter la présence d’anticorps spécifiques dans un sérum, pour mettre en évidence un antigène donné dans un liquide biologique, pour déterminer la zone d'équivalence ou pour évaluer le degré d'identité (nul, total ou partiel) entre différents antigènes. En effet, des antigènes possédant une identité partielle avec celui contre lequel ont été produits les anticorps sont susceptibles de donner une réaction croisée conduisant à des arcs de précipitation d’aspect particulier. On peut ainsi identifier des relations de parenté entre les organismes dont proviennent les antigènes et celui ayant fourni les anticorps. 
En outre, la position du précipité dépendant de la concentration relative des antigènes et des anticorps, il s'agit d'une méthode semi-quantitative.
La technique de double diffusion peut être réalisée en boîte de Pétri ou sur lame. Un gel d'agarose est coulé, soit au fond de boîtes de Pétri de 50 mm de diamètre, soit sur des lames porte-objet de microscopie, et des puits équidistants sont creusés dans le gel. 
Un immunsérum dirigé contre un antigène déterminé est placé dans le puits central et les solutions d'antigènes à tester sont placées dans les puits périphériques. Après quelques heures de diffusion, les arcs de précipitation sont examinés à l’œil nu mais ils peuvent aussi être colorés pour améliorer leur visibilité.
Dans les exemples présentés ci-dessous, les solutions d'anticorps utilisées sont constituées par du sérum de lapin hyperimmunisé contre un antigène (sérum albumine bovine [BSA] et ovalbumine de poule [OVA]) et les solutions d'antigène sont soit des solutions d'albumine, soit des sérums de différents animaux qui contiennent notamment les albumines sériques correspondantes.
  • Protocole
    • Préparation des gels
Mélanger 1,5 g d’agarose et 100 mL de tampon phosphate salé dans un flacon. Chauffer au bain marie à 100°C ou au four à microondes en remuant de temps en temps jusqu'à ce que la solution soit transparente (tout l'agarose doit être parfaitement dissous).
Lorsque le flacon peut être saisi dans la main sans se brûler (environ 60 °C), couler l'agarose sur son support sur une épaisseur d'environ 1 à 1,5 mm.
Le support du gel peut être constitué soit par des boîtes de Pétri de 50 mm de diamètre, ce qui correspond à quelque 4 mL d'agarose par boîte, soit par des lames porte-objet de microscopie (environ 3 mL par lame) en évitant que l'agarose coule en dehors. 
Pour le coulage, boîtes et lames doivent être disposées sur un plan parfaitement horizontal.
Après coulage, laisser refroidir les gels jusqu'à solidification. 
Percer les puits dans le gel avec un emporte-pièces de diamètre 5 mm pour les boîtes ou de diamètre 3 mm pour les lames. Un tube de verre muni d'une poire (pour aspirer l'agarose à éliminer) est suffisant pour percer les puits.
 

Matériel
Préparation des puits

NB  Les boîtes ou les lames peuvent être conservées au réfrigérateur une fois le gel coulé, avant ou après formation des puits,  dans une boîte étanche comportant du papier filtre imprégné d'eau pour maintenir une atmosphère saturée en humidité.
Si les gels ne sont pas utilisés immédiatement après leur préparation, il convient d'y incorporer 0,02 % de nitrure de sodium (NaN3, un antiseptique) dissous dans le tampon PBS. Le nitrure de sodium est hautement toxique et doit être manipulé en portant un masque et des gants.

Guide pour la
formation des puits
Résultat
    • Dépôt des solutions et diffusion
Sécher ensuite le fond de chaque puits avec un essuie-tout enroulé à la dimension du diamètre des puits. 
Placer dans le puits central une goutte d’immunsérum (sérum de lapin anti BSA). 
Placer dans les autres puits une goutte de solution des différents antigènes à tester et noter leur emplacement pour pouvoir les identifier après diffusion.
Mettre les boîtes à incuber à température ambiante dans une enceinte légèrement humidifiée par du papier filtre imprégné d'eau.
Les résultats peuvent être lus 24 h plus tard.
Il est possible de colorer les arcs de précipitation par le noir amido après dessication du gel.
Pour cela, rincer les gels dans des bains successifs de tampon PBS et les sécher.
Les placer ensuite dans une solution de noir amido pendant 2 minutes. Décolorer par des bains successifs d'acide acétique à 5 % puis laisser sécher.
La rétraction de l'agarose lors de la dessication laisse une mince pellicule solide permettant de conserver le support coloré indéfiniment.
  • Résultats

Double diffusion en boîte de Pétri

Numérotation des puits
Puits central
sérum de lapin hyperimmunisé contre la sérumalbumine bovine (BSA)
Puits périphériques
1 : sérum de chèvre ; 2 : sérum de porc ; 3 : sérum de lapin ; 4 : sérum de bœuf ; 5 : sérum de cheval ; 6 : BSA
On observe seulement deux arcs de précipitation formés par l’association entre antigène et anticorps spécifiques.
La BSA (puits 6), antigène contre lequel a été produit l'antisérum, donne un arc de précipitation ainsi que le sérum de bœuf qui contient de la BSA. Les autres sérums ne donnent pas d'arc de précipitation ce qui souligne la spécificité étroite de l'antisérum qui ne réagit avec aucune autre des albumines sériques contenues dans les sérums testés (chèvre, porc, lapin, cheval).

Double diffusion sur lame
Les arcs de précipitation ont été colorés par le noir amido
Côté gauche
Puits central : 
sérum de lapin hyperimmunisé contre la sérumalbumine bovine (BSA)
Puits périphériques : 
(les dépôts ont été faits en partant du puits situé en haut puis en tournant dans le sens des aiguilles d'une montre)
solutions de BSA à 1 mg.mL-1, 500 µg.mL-1, 250 µg.mL-1, 125 µg.mL-1, 65 µg.mL-1, 32,5 µg.mL-1.

S'agissant du même antigène dans tous les puits, il y a continuité entre les différents arcs de précipitation. En outre, la distance des précipités par rapport au puits central augmente lorsque la concentration en antigène diminue car la diffusion d'anticorps en excès par rapport à la zone d'équivalence redissout le précipité qui va se former de plus en plus près du puits contenant l'antigène.
La zone d'équivalence correspond au précipité le plus fin et le plus net soit entre 250 µg.mL-1 et 125 µg.mL-1 de BSA.

Côté droit
Puits central : 
sérum de lapin hyperimmunisé contre la sérumalbumine bovine (BSA) et l'ovalbumine de poule (OVA)
Puits périphériques :
(les dépôts ont été faits en partant du puits situé en haut puis en tournant dans le sens des aiguilles d'une montre)
OVA, MSA (sérumalbumine de souris), MSA, BSA, BSA, OVA

La BSA et l'OVA donnent des arcs de précipitation qui se croisent montrant qu'il n'y a aucune parenté antigénique entre ovalbumine et sérumalbumine bovine. La MSA ne donne pas d'arc de précipitation et n'est donc reconnue par aucun des deux anticorps.


  • Solutions
Tampon phosphate salé (phosphate buffer saline PBS)
NaCl : 8 g
NaH2PO4, 2H2O  : 0,4 g
Na2HPO4, 12H2O  : 2,7 g ou Na2HPO4 anhydre : 1,08 g
Eau distillée : 1 000 mL

Gel d'agarose
Agarose : 1,5 g
Tampon phosphate salé : 100 mL

Noir amido
Dissoudre 0,25 g de noir amido dans 100 mL d'acide acétique à 5 %


Kit immunologie Ouchterlony comportant l'ensemble des produits et matériels nécessaires
SORDALAB
ZA DES POUPETTES 
91580 VILLENEUVE SUR AUVERS 
Téléphone : 0169922672
Fax:0169922674

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