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Initiation aux techniques histologiques


  • Introduction
Même si, dans certains cas favorables, l'observation de matériel biologique avec un microscope optique peut être faite directement, elle nécessite le plus souvent des traitements particuliers des échantillons. En effet, l'observation avec un microscope photonique ordinaire suppose l'utilisation d'échantillons très fins puisque la lumière doit pouvoir les traverser pour qu'une image se forme. Dans ces conditions, les structures cellulaires sont extrêmement difficiles à distinguer et des méthodes de coloration particulières s'avèrent le plus souvent indispensables pour pouvoir étudier cellules et tissus.
Des méthodes simples de préparations extemporanées peuvent être aisément mises en œuvre mais les préparations réalisées de cette manière présentent l’inconvénient de ne pouvoir être conservées plus de quelques heures. C’est pourquoi des méthodes permettant la réalisation de coupes fines d’échantillons biologiques, leur coloration et leur montage dans un milieu qui ne s’abîme pas avec le temps, ont été mises au point par les histologistes. 
La réalisation de préparations microscopiques à partir d’un organe animal nécessite ainsi une fixation préalable des tissus, de façon à «figer » les structures, puis leur imprégnation par un milieu solide pour pouvoir y réaliser des coupes minces. Le milieu d’imprégnation classique est la paraffine qui présente l’avantage d’être liquide à une température supérieure à 56 °C et de se solidifier lorsque la température passe en dessous de cette limite. Une fois imprégnées par la paraffine, les pièces peuvent alors être débitées avec un microtome en coupes fines de quelques micromètres d'épaisseur. Ces coupes subissent ensuite un ensemble de traitements destinés à en colorer les éléments de façon plus ou moins spécifique avant d’être recouvertes d’une résine naturelle ou synthétique permettant de maintenir en place une lamelle couvre-objet assurant leur protection.
Il est important, qu’au cours de leurs études scientifiques, les élèves aient l’occasion d’être confrontés aux principales techniques mises en œuvre dans les laboratoires. Compte tenu, à la fois, de l’importance historique du microscope optique et du fait qu’il s’agit d’un des principaux instruments scientifiques utilisés au cours de leurs études, une initiation aux techniques histologiques présente le plus grand intérêt. 
L’obstacle principal à cette démarche est que, en général, les établissements scolaires ne disposent pas du matériel nécessaire, en particulier le microtome, pour réaliser l’ensemble des opérations nécessaires à la réalisation de préparations microscopiques durables. Toutefois, la coloration et le montage de coupes minces, qui ne nécessitent que des produits courants, peuvent être facilement menés par les élèves à condition de pouvoir obtenir des coupes déjà réalisées par ailleurs, dans un établissement universitaire ou commercial.
La procédure indiquée ici tient compte de ces contraintes. Elle a pour but, à partir de coupes à la paraffine, de mener l’ensemble des opérations nécessaires pour obtenir in fine des préparations microscopiques durables.
Le choix du matériel biologique s’est porté sur le pancréas de mammifère en raison de l’inclusion dans les programmes de première S, mis en œuvre en 2001, d’un chapitre relatif à l’homéostasie glucidique et aux phénotypes diabétiques. Outre l’aspect technique, la réalisation de ce type de préparation microscopique permettra d’observer la double structure, endocrine et exocrine du pancréas (ilôts de Langerhans et acinus) et d’illustrer les caractéristiques des cellules exportatrices de protéines. Enfin, dans les établissement ne disposant pas d’une collection importante de préparations microscopiques, ce type d’activité permet de se constituer à peu de frais une collection de lames de très bonne qualité.
  • Protocole
Le matériel est constitué de coupes fines à la paraffine de pancréas de rat ou de cobaye réalisées à l'UFR de biologie de l'université Pierre et Marie Curie. Le pancréas a subi une fixation classique par le liquide de Bouin avant d'être inclus dans la paraffine. Le bloc a ensuite été débité en coupes de 5 µm d'épaisseur et chaque coupe a été placée sur une lame porte-objet. C'est le matériel de départ.

Coupes fines de pancréas sur lame
L’inclusion de l’échantillon dans la paraffine (nécessaire pour réaliser les coupes) implique son élimination préalablement à la coloration. En effet, la paraffine est hydrophobe tandis que les colorants sont hydrophiles. C'est pourquoi la coloration des coupes comporte une étape de déparaffinage et de réhydratation. Cette étape est assurée par une succession de bains, d’abord dans un solvant permettant l’élimination de la paraffine (toluène ou xylène) puis dans des alcools de titre décroissant, de 100 % (compatible avec le solvant précédent) jusqu’à 70 % (compatible avec l’eau), avant un bain dans l’eau pure assurant la réhydratation finale. Chaque bain dans un solvant est fait dans un flacon cylindrique adapté appelé tube de Borel mais n’importe quel flacon cylindrique fait l’affaire (pot de yaourt, par exemple).

Tubes de Borel
Après réhydratation, la coupe est colorée. Elle est d'abord plongée dans l'hémalun de Masson pendant 5 à 10 minutes, rincée par trois bains successifs dans l'eau de conduite puis dans l'eau distillée.
La coupe est ensuite recouverte d'une goutte d'éosine directement sur la lame. Après deux minutes de coloration, la coupe est rincée par l'eau sous le robinet (attention à ne pas décoller la coupe par un courant d'eau trop violent) puis dans l'eau distillée. Il faut alors procéder à la déshydratation, opération inverse de celle menée au début, avant de pouvoir faire le montage dans la résine.
La déshydratation est réalisée en plongeant successivement la lame dans deux bains d'alcool à 95 % puis dans deux bains d'alcool à 100 % et enfin dans deux bains de solvant (toluène ou xylène). À la sortie du solvant, une goutte de résine de montage (par exemple, Eukit) est disposée sur la coupe et une lamelle est appliquée de façon à ce que la résine recouvre l'ensemble de la coupe. La résine polymérise en une vingtaine de minutes mais on peut accélérer le processus en plaçant la lame sur une plaque d'histologie à 50°C ou simplement sur un radiateur.
La préparation microscopique est alors prête pour l'observation.
Le cliché ci-dessous montre l'ensemble du matériel en place pour les opérations précédentes.

Bains, colorants et résine de montage
  • Résultats
Les clichés présentés ci-dessous ont été obtenus avec un microscope optique muni d'un appareil photographique numérique. 
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Double structure du pancréas
Le pancréas est une glande mixte, exocrine et endocrine. La partie exocrine est constituée d'unités sécrétrices, les acinus, munis de canaux excréteurs.  La partie endocrine est constituée par les îlots de Langerhans dispersés au milieu des acinus. 
 
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Pancréas de cobaye : aspect général (x 250)
Noter les nombreux acinus (exocrines) à gauche et un ilot de Langerhans (endocrine) à droite. Un canal excréteur est visible tout en bas et au milieu du cliché.
 
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Limite entre un ilot de Langerhans et les acinus (x 400)
Les acinus sécrètent les constituants protéiques du suc pancréatique sous forme de zymogène, précurseur inactif d'enzymes digestives.
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Détail d'un acinus (objectif à immersion, x 1000)
Noter la polarité des cellules acineuses avec leur noyau situé au pôle basal tandis que le pôle apical contient du zymogène.

Détail d'un ilot de Langerhans (objectif à immersion, x 1000)
Les îlots endocrines sécrètent notamment l'insuline et le glucagon, hormones intervenant dans l'homéostasie glucidique.
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Canal excréteur (x 400)
Divers autres éléments qui ne sont pas propres au pancréas peuvent être observés sur ces lames. On distingue notamment des vaisseaux sanguins et des adipocytes dans les travées conjonctives.
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Trois adipocytes au milieu des acinus (x 400)
Noter la grande taille de ces cellules dont le contenu cytoplasmique formé de graisses a été extrait lors de la préparation des lames.
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Artériole coupée transversalement (x 100)
Noter les hématies dans la lumière du vaisseau et le tissu conjonctif environnant.

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