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ENZYMOLOGIE
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Publication : novembre 2002


Les corrections ci-dessous sont écrites en bleu. Comme les résultats des mesures peuvent varier entre les différents groupes, on a utilisé ici les résultats obtenus en TP par un des groupes. On a bien évidemment choisi ces résultats en fonction de la qualité des mesures réalisées. 
Quand il y a lieu, on a souligné dans un cadre à part les erreurs les plus fréquentes.
Si besoin est, vous pouvez poser des questions en envoyant un mail : 

1. Calculer la concentration en peroxyde (en g.L-1) obtenue pour chaque dilution et remplir le tableau ci-dessous. 
Calculer également la concentration en méthoxyphénol (en g.L-1) et la noter ci-dessous.
Méthoxyphénol, MM = 124,1 ; solution stock à 8 mmol.L-1
Solution stock de peroxyde à diluer : 3,5 mmol.L-1
 
Concentration en méthoxyphénol (constante) : 0,26 g.L-1
Solution stock : 8 mmol/L. MM : 124,1. Soit 0,992 g/L. 1 mL de cette solution dans un volume de 3,7  mL correspond à une concentration de 0,268 g/L.

H2O2 : volume
H2O2 : concentration en g.L-1
Vitesse initiale mesurée
en Absorbance/s
0
0 (mesure du blanc)
0
40 µL 
1,28 mg/L
3,17 mA.s-1
80 µL
2,56 mg/L
5,87 mA.s-1
200 µL
6,40 mg/L 
8,90 mA.s-1
400 µL
12,86 mg/L
10,22 mA.s-1
600 µL
19,29 mg/L 
 10,49 mA.s-1
800 µL
25,72 mg/L 
10,70 mA.s-1

2. Faire un tirage sur imprimante de la courbe représentant l'évolution de l'absorbance pour une concentration en substrat et le joindre annoté au compte rendu avec toutes les précisions utiles à la compréhension du tracé.
 

Variation de l'absorbance en fonction du temps 
(réaction enzymatique catalysée par la peroxydase : H2O2 + RH2 --------> 2 H2O + R )
L'évolution de l'absorbance permet de suivre la vitesse de formation du produit (gaïacol oxydé) car l'absorbance est directement proportionnelle à la concentration (dans les limites de validité de la loi de Beer-Lambert). 

3. Calculer la vitesse initiale pour les six concentrations testées en utilisant les fonctions appropriées du logiciel et compléter le tableau ci-dessus en précisant l’unité utilisée.
 

Voir tableau
Erreurs les plus fréquentes 
Confusion avec une cinétique de saturation
Pas de titre et pas d'annotations sur le graphique

4. Utiliser les valeurs obtenues pour construire le graphique représentant la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat. Imprimer le graphique présentant les points expérimentaux  et le joindre au compte rendu.
 

Vitesse initiale de la réaction en fonction de la concentration en peroxyde d'hydrogène
(le gaïacol, second substrat, est à une concentration constante, non limitante)

5. Démontrer que l’on peut diviser la courbe correspondante en trois parties présentant des caractéristiques cinétiques différentes. Utiliser les résultats numériques pour appuyer la démonstration.
 

Le graphique représente les vitesses initiales mesurées pour des concentrations croissantes en peroxyde d’hydrogène lors de la réaction catalysée par la peroxydase : H2O2 + RH2 --------> 2 H2O + R.
Dans une première partie (de 0 à 100 µL de substrat), les points sont alignés sur une droite. Ceci montre que pour des concentrations inférieures à 100 µL, toute augmentation de la concentration en substrat se traduit par une augmentation directement proportionnelle de la vitesse initiale. Ainsi, lorsque la concentration est doublée, par exemple de 40 à 80 µL, la vitesse double également (de 3 à 6 mA/s). 
Entre 100 et 400 µL (pointillés), une augmentation de la concentration en substrat se traduit toujours par une augmentation de la vitesse initiale, mais il n’y a plus de proportionnalité directe entre elles puisque les points ne s'alignent plus sur une droite. De plus, l'augmentation de Vi est d'autant moins importante que [S] est plus élevée. Ainsi, un doublement de [S] qui se traduisait par un doublement de Vi dans la première partie se traduit entre 100 et 200 µL par une augmentation de Vi de seulement 1,5 mA/s. 
Au dessus de 400 µL, l’augmentation de la concentration en substrat produit une augmentation très faible de la vitesse initiale. Ainsi, le doublement de [S] de 400 µL à 800 µL produit une augmentation de Vi de seulement 0,5 mA/s ce qui suggère que Vi tend alors vers un maximum de manière asymptotique. 
Erreurs les plus fréquentes 
Absence de démonstration
Non utilisation des résultats numériques
Confusion avec la cinétique réactionnelle en fonction du temps

6. Modéliser les résultats expérimentaux  en utilisant l'équation de Michaelis et les valeurs de Vmax et Km déterminées graphiquement. Imprimer le graphique et le joindre annoté au compte rendu. 
Discuter la pertinence des résultats expérimentaux par rapport au modèle théorique.
 

Modélisation de l'équation de Michaelis-Menten à partir des
résultats mesurés pour six concentrations en peroxyde d'hydrogène
La modélisation graphique est obtenue en traçant la courbe correspondant à l’équation de Michaelis, Vi = (Vmax . [S])/(Km + [S]) en utilisant la valeur de Vmax estimée à partir du graphique (11,5 mA/s) et la valeur de Km correspondante (72 µL soit 74 µmol/L). La discordance entre le tracé expérimental et le modèle mathématique est égal à 4,5 % (comme l'indique le logiciel lors de la modélisation) car certains points ne coïncident pas exactement avec le tracé théorique. Ainsi la vitesse initiale obtenue pour 40 µL de substrat est très légèrement inférieure à la vitesse attendue théoriquement alors que  les vitesses initiales obtenues pour 200 et 400 µL de substrat sont très légèrement supérieures. Les autres points sont situés exactement sur le tracé théorique. Comme les écarts observés pour chaque mesure sont très faibles par rapport aux valeurs théoriquement attendues, on peut assimiler le tracé à l'hyperbole rectangulaire représentant graphiquement l'équation de Michaelis-Menten. La principale source d’incertitude, outre la précision des mesures, est la détermination graphique de Vmax. En effet, les vitesses initiales pour les fortes concentrations en substrat correspondent à une asymptote et Vmax ne peut donc être mesurée directement. En outre, on observe souvent un phénomène d'inhibition par le substrat pour des concentrations élevées en peroxyde ce qui oblige à ne pas tenir compte des points correspondants. 
Compte tenu des approximations dues aux conditions de réalisation des dilutions et des mesures, on en déduit que la peroxydase présente des caractéristiques cinétiques qui vérifient le modèle de Michaelis-Menten. 
Erreurs les plus fréquentes
Absence de discussion
Absence de justification scientifique des choix réalisés (notamment, suppression de points).

7. Modéliser les données expérimentales en utilisant la transformation de Lineweaver et Burk et déterminer graphiquement la valeur des constantes Vmax et Km. Imprimer le graphique et le joindre annoté au compte rendu.
 


Représentation en double inverse selon Lineweaver et Burck
1/Vmax = 0,083. Vmax : 12 mA/s
-1/Km = -12,1.10-3. Km : 82 µL soit 77,5 µmol/L
La représentation de Lineweaver et Burck correspond à la droite d’équation 1/Vi = f (1/S). Elle coupe l’axe des ordonnées en un point correspondant à la valeur de 1/Vmax (ordonnée à l'origine : 0,083) et l’axe des abscisses en un point correspondant à la valeur de – 1/Km (- 12,1.10-3). 

8. Comparer les résultats obtenus par les deux méthodes.
 

Les valeurs des constantes Vmax et Km ont été déterminées graphiquement à partir de la représentation en double inverse (vitesse maximale de 1/0,083 = 12 mA/s et constante de Michaelis égale à –1/12,1.10-3 = 82 µL de peroxyde d'hydrogène correspondant à une concentration de 77,5 µmol/L). Ces valeurs sont proches de celles obtenues avec le modèle de Michaelis (11,5 mA/s et 74 µmol/L respectivement) mais la vitesse maximale a été légèrement sous évaluée par la première méthode. La représentation en double inverse n'est qu'une transformation mathématique de l'équation de Michaelis mais elle permet de déterminer précisément les valeurs des constantes par les coordonnées des points d’intersection de la droite avec les axes. Il n’y a donc pas d’incertitude pour déterminer ces valeurs. Il faut noter cependant que ces valeurs dépendent de la pente de la droite qui ne peut être considérée comme fiable que si elle passe par tous les points expérimentaux. Dans cet exemple, le point correspondant à la concentration la plus faible en peroxyde n'a pas été pris en compte dans la modélisation car la valeur de Vi correspondante, légèrement différente de la valeur théorique attendue, introduisait une distorsion excessive dans la modélisation en double inverse. Un écart minime par rapport au tracé théorique de Michaelis est considérablement amplifié par la modélisation en double inverse.
Erreurs les plus fréquentes
Absence de comparaison
Choix arbitraire des points sans justification scientifique
Absence d'esprit critique sur les méthodes utilisées

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