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Modèles moléculaires

Électrophorèse des hémoglobines A et S 
sur bande d'acétate de cellulose



Le principe de la simulation utilisée est le même que celui décrit pour l'électrophorèse des hémoglobines sur gel d'agarose supporté correspondant à la distribution des hémoglobines A et S dans trois générations au sein d'une famille. Il est indiqué à la page "Identification des phénotypes moléculaires et des génotypes par électrophorèse de l'hémoglobine" et ne sera donc pas repris ici où l'on se limitera aux particularités liées à l'utilisation de bandes d'acétate de cellulose comme support d'électrophorèse.
Les échantillons utilisés pour mener l'électrophorèse sont des solutions réalisées artificiellement avec des hémoglobines A et S du commerce dissoutes à raison de 2,5 mg/mL dans du tampon d'électrophorèse préalablement oxygéné par une agitation vigoureuse. Pour chaque "membre de la famille", on place dans un tube Eppendorf étiqueté 100 µL de solution. Les échantillons correspondant aux individus homozygotes pour HbA sont constitués de 100 µL de la solution d'hémoglobine A, les échantillons correspondant aux individus homozygotes pour HbS sont constitués de 100 µL de la solution d'hémoglobine S et les échantillons correspondant aux individus hétérozygotes sont constitués d'un mélange de 50 µL de la solution d'hémoglobine A et de 50 µL de la solution d'hémoglobine S. Un tel volume permet de réaliser une vingtaine de pistes d'électrophorèse. 
  • Protocole
1. Mettre à tremper les bandes d'acétate de cellulose dans le tampon d'électrophorèse (tampon tris-véronal) pendant 10 à 20 minutes.

Trempage

2. Essorer l'excès de tampon en plaçant les bandes entre deux feuilles de papier absorbant (essuie-tout).

Essorage
3. Placer la bande sur le portoir en veillant à disposer la face absorbante vers le haut.
La bande doit être tendue et ses extrémités doivent dépasser suffisamment pour tremper dans le tampon une fois le support placé dans la cuve.

NB Le dispositif de fixation de la bande sur le support varie selon les fabricants.

 


Mise en place de la bande sur le support
4. Remplir les deux compartiments de la cuve avec un même volume de tampon d'électrophorèse.

5. Mettre en place le(s) support(s) dans la cuve.

6. Prélever un échantillon et le déposer sur la bande, déjà en place sur son support, au tiers de l'extrémité, côté cathode (borne noire) en prenant garde que la bande soit bien horizontale et que l'échantillon ne coule pas.


Bandes en place dans la cuve
On peut prélever et déposer les échantillons soit avec une micropipette, soit avec un capillaire, soit avec un applicateur  comme celui présenté ci-dessous réalisé avec un bouchon et deux trombonnes pour permettre un dépôt linéaire.


Applicateur



Dépôts effectués sur une bande
7. Recommencer pour chaque échantillon en laissant un espace suffisant pour ne pas risquer la fusion des échantillons qui diffusent légèrement lors du dépôt. Utiliser un applicateur différent pour chaque échantillon ou sinon, bien nettoyer l'applicateur entre chaque dépôt.

8. Fermer la cuve et mettre sous tension (environ 1 h de migration à 150 V).
 


Cuve et générateur pendant la migration
9. Après migration, placer les bandes dans la solution de rouge ponceau pendant 10 minutes.

Coloration 
10. Décolorer le fond dans des bains successifs d’acide acétique à 5 %. Agiter le cas échéant pour accélérer la décoloration.
Bains de décoloration
  • Résultats
L'hémoglobine S moins chargée que l'hémoglobine A en raison de la substitution d'un acide glutamique par une valine en position 6 de la chaîne de la bêta globine migre moins loin et peut ainsi être distinguée sur la bande d'acétate de cellulose.

Electrophorèse des hémoglobines A et S
On se référera au paragraphe "exploitation" de la page consacrée à l'électrophorèse sur gel des hémoglobines A et S  pour l'utilisation pédagogique des résultats.
  • Solutions
Tampon tris-véronal
Tris (hydroxyméthyl) aminométhane : 7,2 g
Acide diéthylbarbiturique : 1,82 g
Diéthylbarbiturate de sodium : 10,2 g
Eau distillée : 1 L
Solution de coloration : rouge ponceau
Rouge ponceau : 2g 
Acide trichloracétique : 30g 
Eau distillée : 1 L
Solution de décoloration
Acide acétique à 5 %


  • Kit électrophorèse des hémoglobines

  • SORDALAB
    ZA DES POUPETTES 
    91580 VILLENEUVE SUR AUVERS 
    Tél: 0169922672 - Fax:0169922674 
  • Hémoglobines A et S 

  • SIGMA. L'Isle d'Abeau Chesnes BP 701 - 38297 Saint Quentin Fallavier
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