Vous êtes sur ATP. Ce bandeau vous donne accès aux autres rubriques de Bmedia. Accueil
Biochimie 
et biologie moléculaire
Biologie 
du développement
Biologie cellulaire Zoologie Biologie végétale Physiologie végétale Informations sur le site Liens externes

 
Sans
ordinateur
RETOUR A LA PAGE D'ACCUEIL



Microbiologie
Biochimie
Biologie cellulaire
Génétique
Physiologie animale
Physiologie végétale
Evolution
Organismes modèles
Avec ordinateur
ExAO
Modèles moléculaires

Identification des phénotypes moléculaires et 
des génotypes par électrophorèse de l'hémoglobine


  • Principe
Plusieurs maladies héréditaires qualifiées d'hémoglobinopathies, comme les thalassémies et la drépanocytose, affectent l'un des deux gènes codant les chaînes de l'hémoglobine humaine adulte, hémoprotéine tétramérique constituée de deux chaînes alpha et de deux chaînes bêta. La drépanocytose est une affection génétique due à une mutation ponctuelle dans le gène codant la chaîne bêta. Elle est caractérisée par la substitution de l'acide glutamique en position 6 de la structure primaire par une valine. Il en résulte une hémoglobine anormale (HbS) qui a tendance à polymériser lorsque la pression partielle en dioxygène diminue, en particulier dans le sang périphérique, contrairement à l'hémoglobine normale (HbA) qui ne présente pas cette propriété. La présence de cette hémoglobine anormale dans les globules rouges aboutit à une pathologie qui peut être plus ou moins grave en fonction de divers autres facteurs génétiques et environnementaux, principalement chez les homozygotes, et elle peut être détectée par l'observation microscopique du sang qui contient des hématies déformées, qualifiées de falciformes (en forme de faucille). 
La simple substitution de la valine en position 6 dans la structure primaire de la chaîne bêta confère à l'hémoglobine S une charge électrique globale inférieure à celle de l'hémoglobine A. Il en résulte que lorsque les deux hémoglobines sont placées sur un gel d'électrophorèse, elles ne migrent pas de la même façon ce qui permet de les identifier dans un simple hémolysat de globules rouges. On peut aisément en déduire le phénotype moléculaire du porteur et en déduire son génotype.
Dans l'enseignement de la biologie, le cas de la drépanocytose est prototypique. En effet, il constitue non seulement un exemple historique de vérification du bien fondé du "dogme central de la biologie moléculaire", mais aussi des relations complexes entre génotype et phénotype qui interviennent dans l'évolution parce que l'allèle muté, bien que morbide, s'est maintenu à un taux élevé dans le pool génique de certaines populations en raison de l'avantage sélectif qu'il confère dans les zones d'endémie du paludisme. En effet, le parasite responsable de cette maladie, le Plasmodium, se révèle moins pathogène chez les porteurs de l'allèle muté.
Pour toutes ces raisons, il est intéressant d'utiliser l'électrophorèse pour identifier les deux hémoglobines, par exemple dans une simulation de situation réelle.
  • Protocole
Sur le plan technique, il s'agit d'une simulation pouvant correspondre à la distribution des hémoglobines A et S dans trois générations au sein d'une famille. Il s'agit, à partir des résultats de l'électrophorèse des hémoglobines des différents membres de cette famille virtuelle, de déterminer leurs phénotypes moléculaires, d'en déduire leur génotype et de dresser l'arbre généalogique correspondant. 
Les échantillons utilisés pour mener l'électrophorèse sont des solutions réalisées artificiellement avec des hémoglobines A et S du commerce dissoutes à raison de 2,5 mg/mL dans du tampon d'électrophorèse préalablement oxygéné par une agitation vigoureuse. Pour chaque "membre de la famille", on place dans un tube Eppendorf étiqueté 100 µL de solution. Les échantillons correspondant aux individus homozygotes pour HbA sont constitués de 100 µL de la solution d'hémoglobine A, les échantillons correspondant aux individus homozygotes pour HbS sont constitués de 100 µL de la solution d'hémoglobine S et les échantillons correspondant aux individus hétérozygotes sont constitués d'un mélange de 50 µL de la solution d'hémoglobine A et de 50 µL de la solution d'hémoglobine S.
Un tel volume permet de réaliser 20 pistes d'électrophorèse avec la technique des gels supportés prêts à l'emploi. On se référera à l'arbre généalogique du paragraphe "exploitation" pour la correspondance entre membres de la famille et solutions d'hémoglobine. 
L'électrophorèse est menée à 110 V pendant 50 minutes sur un Midigel Hémoglobine (BIOMIDI) selon la procédure indiquée à la page du protocole.
  • Résultats
Le recours à l'électrophorèse peut être justifié par le problème suivant : chez les membres d'une même famille dont un fils est atteint de drépanocytose, on a extrait l'hémoglobine des globules rouges et on a soumis les échantillons à l'électrophorèse sur gel d'agarose afin d'identifier les génotypes pour construire l'arbre généalogique de la famille. Les sept membres dont l'hémoglobine a été analysée sont les deux parents (pistes 1 et 2), leurs quatre enfants (pistes 3 à 6) et un petit enfant (piste 7). En outre, deux références sont constituées par un échantillon d'hémoglobine S (piste 8) et un échantillon d'hémoglobine A (piste 9).
Le gel ci-contre montre les résultats obtenus.
Cliquer sur l'image pour l'agrandir
Electrophorèse des hémoglobines A et S
  • Exploitation
Dans un premier temps, on identifie les bandes d'hémoglobine pour en déduire les génotypes des différents individus.
 
 

Cliquer sur l'image pour l'agrandir
Interprétation

On peut alors construire l'arbre généalogique de la famille :

Arbre généalogique
NB Les numéros des individus correspondent aux numéros des pistes d'électrophorèse


  • Midigels Hémoglobines

  • BIOMIDI
    Parc de la Plaine, 35 avenue Marcel Dassault
    31500 TOULOUSE - FRANCE
    05 61 34 07 14 
  • Hémoglobines A et S 

  • SIGMA. L'Isle d'Abeau Chesnes BP 701 - 38297 Saint Quentin Fallavier

Page d'accueil de BMédia
Tous droits réservés
BMédia, 1999-2004
Contact :
Envoyer un courrier